黄芪甲苷葡萄糖注射液抗缺血性心肌损伤的实验研究※

白 月 李雅楠 袁 炜 牛敏霞 刘文康 黄怀鹏

(河北中医学院药学院2019级硕士研究生，河北 石家庄 050200)

缺血性心脏病(ischemic heart disease，IHD)主要是由血管狭窄、粥样硬化或者梗死造成心脏局部血供减少、心肌损伤的一组疾病，包括冠心病、心绞痛、急性冠状动脉综合征等[1]。随着经济的发展和人们生活条件的改善，我国IHD的患病率和死亡率持续上升。最新调查结果显示，2018年我国冠心病患者约为1100万，其中每10万患者就有156.73人死亡[2]。IHD已成为严重威胁我国国民健康的主要疾病之一[3]。

中医学将IHD归于“胸痹”“真心痛”范畴。中医学认为，气虚血瘀是胸痹、真心痛的重要病机，气虚则无力推动血行而致瘀，血瘀又会进一步加重气虚，形成恶性循环[4]。血液流变学异常亦是胸痹发生、发展的重要原因[5]。缺血、缺氧或腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)合成酶功能障碍会导致气虚，进而引起血液循环功能障碍，最终导致血液流变学异常。中医药在治疗IHD方面积累了丰富的经验。尚云用黄芪汤加减化裁治疗冠心病无症状性心肌缺血、稳定型心绞痛等多种心脏疾病疗效显著[6]。邸海侠等[7]通过对147首治疗心肌缺血的方剂进行分析发现，黄芪的使用频次位居第二。黄芪被誉为“补药之长”，具有补气活血的功效。近年来，黄芪复方及单体成分在IHD方面的应用和疗效备受关注。以黄芪为君药的中药复方制剂芪参益气滴丸可通过调控低氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路来调节动物细胞对氧气的感知和反应，从而对缺血心肌细胞发挥保护作用[8]。复方黄芪养心合剂可改善气虚血瘀型冠心病不稳定性心绞痛患者的临床症状及中医证候积分[9]。现代药理学研究表明，黄芪含有黄酮类、皂苷类、多糖类等多种有效成分，其中黄芪甲苷为黄芪的皂苷成分，对大鼠缺血心肌具有保护作用[10-11]。黄芪甲苷葡萄糖注射液是以黄芪甲苷为主要成分制成的无菌注射液。本实验旨在建立多种心肌缺血损伤动物模型，评价黄芪甲苷葡萄糖注射液抗心肌缺血损伤的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级C57BL/6小鼠110只，6周龄，体质量18～22 g，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0020。SPF级SD大鼠160只，8周龄，体质量200～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0006。动物分笼饲养于温度(23±1)℃、湿度(35±5)%、12 h明暗交替的环境，自由饮水进食。所有动物实验均经河北中医学院附属石家庄平安医院伦理委员会批准同意(批号：20200805)，并严格按照标准执行。

1.1.2 药品与试剂 黄芪甲苷葡萄糖注射液，由山东绿叶天然药物研究开发有限公司现代中药研究室提供，规格：20 mg/100 mL，批号：051001；盐酸维拉帕米注射液(哈药集团三精制药股份有限公司，国药准字H23020958，规格：2 mL/5 mg，批号：180921)；硝酸异山梨酯注射液(齐鲁制药有限公司，国药准字H10960035，规格：10 mL/10 mg，批号：04110382)；水合氯醛(分析纯，天津市光复精细化工研究所，批号：20150622)；盐酸异丙肾上腺素(ISO，山东科源制药有限公司，国药准字H37022268，批号：101443898)。

1.1.3 主要实验仪器 美国BIC 16导生理记录仪(美国BIC公司)，血液流变学测试仪(型号：E3-9XW，成都麦赛科贸有限公司)，单道心电图机(型号：FX-2111，北京福田电子医疗仪器有限公司)，多导同步心外膜电图系统(型号：ALC-EECG，上海奥尔科特生物科技有限公司)，电子秒表。

1.2 方法

1.2.1 耐缺氧实验

1.2.1.1 常压耐缺氧实验 取小鼠50只，随机分为5组，即溶媒组、维拉帕米组(2 mg/kg)及黄芪甲苷葡萄糖注射液高剂量组(以下简称高剂量组，8 mg/kg)、黄芪甲苷葡萄糖注射液中剂量组(以下简称中剂量组，4 mg/kg)和黄芪甲苷葡萄糖注射液低剂量组(以下简称低剂量组，2 mg/kg)，每组各10只。各组分别予尾静脉注射相应药液(溶媒组予等容积5%葡萄糖注射液)，10 min后将各组小鼠放入底部有钠石灰的广口瓶(规格：125 mL，钠石灰5 g，用于吸收CO2和水)中，密闭(用凡士林涂抹瓶口防止漏气)，以小鼠腹部无起伏为观察截点，用电子秒表记录小鼠从广口瓶密闭到停止呼吸的时间。

1.2.1.2 心肌缺血小鼠耐缺氧实验 取小鼠60只，随机分为6组，即正常组、溶媒组、维拉帕米组(2 mg/kg)、高剂量组(8 mg/kg)、中剂量组(4 mg/kg)和低剂量组(2 mg/kg)，每组各10只。各组分别予尾静脉注射相应药液(正常组、溶媒组予等容积5%葡萄糖注射液)，10 min后，除正常组外，其余5组小鼠参照文献[12]予ISO 10 mg/kg皮下注射诱导心肌缺血，15 min后将6组小鼠均放入底部有钠石灰的广口瓶(规格：125 mL，钠石灰5 g)中，用凡士林涂抹瓶口密闭，以小鼠腹部无起伏为观察截点，用电子秒表记录小鼠从广口瓶密闭到停止呼吸的时间。

1.2.1.3 气管夹闭心电消失实验 取大鼠50只，随机分为5组，即溶媒组、维拉帕米组(1 mg/kg)、高剂量组(4 mg/kg)、中剂量组(2 mg/kg)和低剂量组(1 mg/kg)，每组各10只。各组大鼠均予10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，仰位，固定，颈部正中切口，分离气管，分别尾静脉注射相应药液(溶媒组予等容积5%葡萄糖注射液)，10 min后夹闭大鼠气管，开始计时，连接心电图Ⅱ导联，至心电图Ⅱ导联持续出现一平直线记为大鼠心电消失时间。

1.2.2 抗心肌缺血损伤实验

1.2.2.1 心电ST段总偏移实验 取大鼠50只，随机分为5组，即溶媒组、硝酸异山梨酯组(2 mg/kg)、高剂量组(4 mg/kg)、中剂量组(2 mg/kg)和低剂量组(1 mg/kg)，每组各10只。各组大鼠均予10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，记录正常心电图后，分别尾静脉注射相应药液(溶媒组予等容积5%葡萄糖注射液)，给药10 min后予ISO 6 mg/kg皮下注射，记录ISO皮下注射后1、5、10、15 min的Ⅱ导联心电图，测量各时间点心电图的ST段偏移，以1、5、10、15 min的ST段偏移之和作为总ST段偏移幅度(∑ST)。

1.2.2.2 血液流变学实验 取大鼠60只，随机分为6组，即假手术组、溶媒组、硝酸异山梨酯组(2 mg/kg)、高剂量组(4 mg/kg)、中剂量组(2 mg/kg)和低剂量组(1 mg/kg)，每组各10只。各组大鼠均予10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，连接生理记录仪，自大鼠左侧3～4肋间开胸，暴露心脏，于肺动脉圆锥及左心房间找出冠状动脉左前降支(LAD)，除假手术组外，其余5组在距起点2～3 mm处用6-0带线缝合针进行结扎，结扎后肉眼可见心尖由红变白，心电图Ⅱ导联显示ST段抬高、T波倒置(见图1)，提示心肌缺血模型建立成功，将心脏送回胸腔，挤出胸腔内血液和气体，立即缝合胸壁。假手术组不进行结扎，其余步骤同其余5组。各组分别连续尾静脉注射相应药液(假手术组、溶媒组予等容积5%葡萄糖注射液)3 d，末次给药60 min后，均予10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉采血5 mL(麻醉、采血前16 h禁食不禁水)， 50 U肝素抗凝，用血液流变学测试仪测定全血黏度(低切、中切、高切)、血浆黏度和红细胞比容。

图1 心肌缺血大鼠造模前后心电图

2 结果

2.1 常压缺氧实验各组小鼠呼吸时间比较 见表1。

表1 常压缺氧实验各组小鼠呼吸时间比较

由表1可见，与溶媒组比较，维拉帕米组、高剂量组及中剂量组小鼠呼吸时间均显著延长(P<0.05)。维拉帕米组、高剂量组、中剂量组及低剂量组组间两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2 心肌缺血小鼠耐缺氧实验各组小鼠呼吸时间比较 见表2。

表2 心肌缺血小鼠耐缺氧实验各组小鼠呼吸时间比较

由表2可见，与正常组比较，溶媒组和低剂量组小鼠呼吸时间缩短(P<0.05)。与溶媒组比较，维拉帕米组、高剂量组及中剂量组小鼠呼吸时间均显著延长(P<0.05)。维拉帕米组、高剂量组、中剂量组及低剂量组组间两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.3 气管夹闭心电消失实验各组大鼠心电消失时间比较 见表3。

表3 气管夹闭心电消失实验各组大鼠心电消失时间比较

由表3可见，与溶媒组比较，维拉帕米组、高剂量组及中剂量组大鼠心电消失时间均显著延长(P<0.05)。维拉帕米组、高剂量组、中剂量组及低剂量组组间两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.4 心电ST段总偏移实验各组大鼠∑ST比较 见表4。

表4 心电ST段总偏移实验各组大鼠∑ST比较

由表4可见，与溶媒组比较，硝酸异山梨酯组、高剂量组及中剂量组大鼠∑ST均明显降低(P<0.05)。硝酸异山梨酯组、高剂量组、中剂量组及低剂量组组间两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.5 血液流变学实验各组大鼠血液流变学指标比较 见表5。

由表5可见，与假手术组比较，溶媒组和低剂量组大鼠全血黏度(低切、中切、高切)、血浆黏度和红细胞比容均升高(P<0.05)。与溶媒组比较，硝酸异山梨酯组、高剂量组、中剂量组大鼠全血黏度(低切、中切、高切)、血浆黏度和红细胞比容均降低(P<0.05)。硝酸异山梨酯组、高剂量组、中剂量组及低剂量组全血黏度(低切、中切、高切)、血浆黏度和红细胞比容组间两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

表5 血液流变学实验各组大鼠血液流变学指标比较

3 讨论

黄芪属膜荚黄芪或蒙古黄芪的干燥根，具有补气固表、托毒排脓、利尿、生肌等作用，常用于气虚乏力、久泻脱肛、自汗、疮口久不愈合等。补气生血经典名方当归补血汤由黄芪、当归5∶1组成，主治血虚阳浮发热证。现代医学研究发现，当归补血汤治疗心血管系统疾病效果突出，包括抗动脉粥样硬化、抗心肌缺血、促进血管新生等[13]。基于数据挖掘对国医大师刘祖贻561首含黄芪处方用药规律研究发现，黄芪不同用量及多种配伍灵活应用可治疗多种病症[14]。

黄芪甲苷作为黄芪皂苷类成分之一，被视为黄芪质量控制的生物标志物[15-16]，具有抗炎、抗氧化应激、强心降压及增强免疫力等药理作用[17]，在治疗心脑血管疾病方面应用广泛且取得一定成果。研究发现，黄芪甲苷可降低心肌梗死大鼠的梗死面积，通过抗炎、抗心肌纤维化改善大鼠急性心肌梗死后的心室重构[18-19]。黄芪甲苷可激活HIF-1α信号，减轻心肌缺血再灌注损伤[20]，亦可通过抗心肌细胞凋亡、抗氧化应激等发挥保护心肌作用[21]。此外，黄芪甲苷在改善血管内皮损伤、保护脑神经及脑血管等方面亦发挥着重要作用[22]。

心肌缺血时，心肌细胞缺氧及各种营养物质供应不足，出现代谢异常和代谢产物异常堆积，最终致心肌细胞死亡。心脏缺血导致大鼠心脏组织细胞的缺氧，是一个基本的和重要的病理生理环节。同时，心肌缺血的形成与血液流变异常有密切联系，血液黏度升高使血流阻力增加，流速减慢，甚至造成血液停滞，最终影响冠状动脉供血，诱发或加重心肌缺血[22]。因此，提高心肌的耐缺氧能力及改善血流状态为防治缺血性心脏病的基础。本研究结果显示，在耐缺氧实验中，黄芪甲苷葡萄糖注射液中、高剂量组均可不同程度地延长正常小鼠和ISO诱导的心肌缺氧小鼠在密闭缺氧条件下的存活时间(P<0.05)，提示黄芪甲苷葡萄糖注射液可增强小鼠心脏在缺氧状态下的耐受性。在气管夹闭状态下，黄芪甲苷葡萄糖注射液中、高剂量组大鼠心电消失时间显著延长(P<0.05)，提示黄芪甲苷葡萄糖注射液能提高小鼠心肌细胞抗缺血缺氧的能力，可有效保护心肌细胞。

心电图ST段变化是判断心肌缺血与否的主要指标[3]。本实验中，与溶媒组相比，黄芪甲苷葡萄糖注射液中、高剂量组心电图∑ST显著降低(P<0.05)，提示该药物可改善缺血心肌细胞的功能，保护缺血心肌。血液流变学作为血脉痹阻的客观指标，其异常多与稳定型心绞痛痰瘀有关，临床上表现为高黏度、高凝聚状态及血小板聚集率增高等[23]。本实验结果表明，与心肌缺血大鼠溶媒组相比较，黄芪甲苷葡萄糖注射液中、高剂量组全血黏度(低切、中切、高切)、血浆黏度和红细胞比容均明显降低(P<0.05)。证明黄芪甲苷葡萄糖注射液可改善心肌缺血大鼠的血液流变学指标。

综上所述，黄芪甲苷葡萄糖注射液中、高剂量可改善模型动物的心肌缺血，其抗心肌缺血作用可能与增强心肌细胞耐缺氧能力、改善心肌缺血模型血液流变性有关。