加味九分散对痛风性关节炎大鼠TRPV1 表达的影响

刘东武，高明利，于 静

（辽宁中医药大学附属医院风湿免疫科，沈阳 110032）

痛风是尿酸盐结晶诱发的晶体性关节炎，关节局部红肿热痛是本病主要临床特点[1]。瞬时电位感受器香草酸受体1（transient receptor potential vanilloid-1，TRPV1）是温度瞬时受体感受器的成员之一，参与热痛觉敏化和炎症反应等多种生理病理过程[2]。目前TRPV1 是疼痛治疗的重要靶点之一。加味九分散由马钱子、麻黄、乳香、没药、大黄、薄荷、姜黄组成，具有活血散瘀，消肿止痛的作用。本实验通过观察加味九分散外敷对急性痛风性关节炎动物模型关节皮肤和关节囊TRPV1 表达影响探讨本方止痛作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料（220±20）g 雄性SD 大鼠，辽宁长生生物技术股份有限公司提供，动物合格证号scxk（辽）2015-0001。加味九分散组成：制马钱子、麻黄、制乳香、制没药、姜黄、大黄、薄荷。药材采购于辽宁中医药大学附属医院，取以上药各30 g，将药材打粉，过筛，混匀后乙醇调糊外用。扶他林乳胶剂购自中美天津史克制药有限公司，批号：7M5L。尿酸钠结晶（MUS）（Sigama 公司），细胞蛋白抽取试剂盒、RIPA 裂解液（碧云天生物技术有限公司），TRPV1 抗体和二抗（爱博泰克生物科技有限公司），western 蛋白marker，BCA 蛋白定量试剂盒（凯基生物技术股份有限公司）。

1.2 分组与造模 将60 只雄性SD 大鼠随机分4 组，分别为空白对照组（K）、模型组（M）、加味九分散组（Z），每组15 只。除空白对照组外均用尿酸盐结晶局部注射造模。采用 Coderre 等[3]设计的痛风性关节炎大鼠造模方法。

称取 0.2 g 尿酸钠，充分研细，加入0.9%氯化钠注射液4 mL，配成 5%尿酸钠混悬液，无菌操作，用4 号注射针头，将 5%尿酸钠溶液0.1 mL 注入各组大鼠右后足内踝的胫跗关节腔内，每只动物仅注射1 次。针头探及关节囊有落空感为度，注射完成后观察胫跗关节腔肿胀情况。

1.3 实验给药 大鼠在实验室驯养1 周后造模，造模1 h 后加味九分散组开始用药，药物外敷每8 h 1 次，共用药6 次，每次维持1 h。

1.4 标本取材方法 用药48 h 后处死大鼠，取关节周围皮肤和关节囊组织，提取关节局部皮肤和关节囊组织蛋白。

1.5 指标检测 用关节皮肤及关节囊组织，蛋白提取，蛋白做western-blot，步骤按照试剂说明书进行，使用Image J 软件对蛋白表达进行半定量分析，计算TRPV1相对表达量。

1.6 统计学分析 采用 SPSS 23.0 软件包对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较经方差齐性分析后采用成组设计的t检验。

2 结果

Wetern-blot关节囊及关节皮肤TRPV1表达 见表1。

表1 关节囊及关节皮肤TRPV1 表达（，n=15）

表1 关节囊及关节皮肤TRPV1 表达（，n=15）

注：与空白组比较，# P ＜0.01，与模型组比较，△P ＜0.01

3 讨论

中医认为痛风为湿热瘀阻[4]，应用清热活血通络药物治疗，针灸等中医外治法对于痛风性关节炎急性期治疗效果明显[5]。

《内经》中早有关于病机和治法的论述：“诸病胕肿，疼痛惊骇，皆属于热”“诸痛疮疡，皆属于心（火）”“热者寒之”。中医理论认为热邪痹阻关节可以引发关节红肿、灼热、疼痛，清热通络药物可以减轻湿热痹阻引发的疼痛症状。

瞬时受体电位（Transient Receptor Potential，TRP）通道首次在基因突变的果蝇中被发现[6]，是一类跨细胞膜的非选择性阳离子通道，在感知温度、pH 值、疼痛敏化等方面具有重要作用[7]。1997 年，Caterina等[2]在神经元中首次克隆出了第一个辣椒素敏感受体，并命名为香草酸瞬时受体电位通道 transient receptor potential vanilloid-1(TRPV1) 。TRPV1 广泛分布于神经元、脏器上皮细胞、免疫细胞等[8-9]。TRPV1 通道在体内或体外均可被温度刺激 (温度＞ 42 ℃)激活，导致疼痛敏化，还可被多种内源性及外源性理化刺激激活，酸性环境(pH 值＜5.9)、辣椒素以及内源性质子[2]。TRPV1 通道激活表达异常参与多种疾病的发病过程，如哮喘[10]、皮肤病[11]、关节炎[12]等等。以TRPV1 蛋白通道激动剂及拮抗剂为基础开发的镇痛药越来越多，包括辣椒素、辣椒平（capsazepine）及苯并咪唑等[13]。

TRPV1 的发现给中医研究者带来了希望，成为了寒凉类和温热类等中药及方剂止痛作用机制研究的热点。部分热性中药成分能够提高动物机体能量代谢过程。周海玉[14]认为，热性中药热性属性与其所含的TRPV1 通道激动剂含量相关，可以提高机体感知温度的活性，从而增加机体的能量代谢。吴茱萸含有TRPV1 受体激动剂，其镇痛作用与TRPV1 的脱敏有关[15]。生姜中含有6-姜酚具有类香草醇结构，作为一种TRPV1 激活剂，可激活 TRPV1 受体并减少NFκB、细胞周期蛋白D1 含量，进而抑制肿瘤进展[16]。生物毒素（如狼蛛毒素）[17]等也可激活或调控TRPV1通道从而起到止痛作用。人参总皂苷对 TRPV1 受体有激动剂和抑制剂的双向调节作用，在不同的内环境条件下产生不同作用[18]。白芷水提液具有TRPV1 通道抑制活性，从而起到止痛作用[19]。Sui 等[20]发现芍药甘草汤通过减少TRPV1 蛋白表达及降低该通道活性对关节炎疼痛大鼠模型起到镇痛作用。电针治疗也可以通过减少TRPV1 表达来减轻病理性疼痛[21]。

九分散由《中国药典》收录，源于费山寿《急救应验良方》，由马钱子、麻黄、乳香、没药4 味药组成。《慈禧光绪医方选》《青囊全集》分别记载九分散，药物组成与《中国药典》记载之方药略有差异。方中马钱子、麻黄辛味走窜，善通络止痛，乳香、没药行气活血善治气滞血瘀。古时本方多用于跌打损伤，现代医家也将本药用于治疗痹证之疼痛症状[22]。加味九分散在本方基础上加用大黄、姜黄、薄荷组成。大黄、姜黄活血化瘀，清热利湿消肿，用于治疗热痹。加味九分散具有清热通络，活血止痛作用。本研究证明加味九分散通过减少痛风性关节炎大鼠局部TRPV1 表达达到止痛作用。