GASC1在肺腺癌组织中表达的临床意义及预后价值

李晓丹 原翔 刘怡文 李治岐 万里新

肺腺癌(lung adenocarcinoma cancer，LAC)是非小细胞肺癌的常见病理组织学类型之一，[1-3]患者预后较差，临床五年生存率在10%～15%[4]。鳞状细胞癌扩增基因1(Gene Amplified in Squamous Cell carcinoma 1,GASC1)，也称KDM4C， 在食管癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤及髓母细胞瘤等多种肿瘤中都有高频扩增或异常高表达，并且与肿瘤的恶性程度密切相关，表现为导致细胞永生化，增强癌细胞的侵袭性，与不良预后相关[5-9]然而目前尚没有研究评估GASC1作为生物指标与肺腺癌预后之间的关系，因此本研究拟通过分析100例肺腺癌组织GASC1的表达情况，评估其临床意义及预后价值，为临床肺腺癌的诊疗提供新的思路。

资料与方法

一、研究对象及标本

100例肺腺癌组织标本，均来自2016年1月至2016年11月南阳市中心医院胸外科接受手术治疗的肺腺癌患者。其中男53例，女47例；<60岁37例，≥60岁63例；有吸烟史36例，无吸烟史64例；高分化、中分化和低分化分别有28、56与16例；有淋巴结转移者37例，无转移者63例；TNM分期为Ⅰ/Ⅱ和Ⅲ期者分别有63例与37例。患者均为初次接受治疗。该项目经过南阳市中心医院伦理委员会的同意，并于术前获得患者书面知情同意。

二、免疫组化

组织蜡块切片经二甲苯脱蜡、乙醇梯度脱水，柠檬酸盐修复液微波加热修复，免疫组化S-P超敏试剂盒(美国R&D公司)检测标本组织GASC1(抗鼠单克隆抗体1 ∶200，abcam)表达，室温孵育、PBS冲洗，苏朩素复染、酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。GASC1为胞核和胞质出现棕黄色颗粒。随机挑选5个高倍镜视野，根据染色强度(0分，浅黄色；1分，棕黄色；2分，棕褐色；3分，深褐色)和阳性细胞百分比(0分，≥0%且<5%；1分，≥5%且<25%；2分，≥25%且<50%；3分，≥50%且<75%；4分≥75%)的乘积对每个视野进行免疫组化综合评分：0分为阴性；1～12为阳性，5个视野免疫组化评分均值为最终结果。

三、GASC1 mRNA检测

用液氮将肺腺癌及癌旁组织标本冷冻后，用石臼研磨呈粉末状，用Trizol法提取RNA，后将1 μg RNA进行反转录，根据试剂盒(北京鼎国)步骤合成cDNA，根据Q-PCR(诺唯赞)试剂盒步骤检测GASC1 mRNA相对表达量。GASC1引物序列为：上游5′-TGGATCCCAGATAGCAATGA-3′，下游5′-TGTCTTCAAATCGCATGTCA-3′；内参GAPDH引物序列为：上游5′-GCCACATCGCTCAGACACC-3′，下游 5′-GATGGCAACAATATCCACTTTACC-3′。GSK3β和GAPDH退火温度均为60℃，经40个循环扩增，计算方法为2(-ΔΔCt)。

四、Western blot检测

用液氮将肺腺癌及癌旁组织标本冷冻后，用石臼研磨呈粉末状，用12% SDS-聚丙酰胺凝胶进行蛋白电泳及转膜，脱脂奶粉封闭PVDF膜(密理博)1h，加用TBST稀释的一抗(GASC1, 1 ∶300； GAPDH，1 ∶2 000，世纪康维)4℃过夜，震荡洗膜，加入二抗标记(1 ∶3 000，世纪康维)室温孵育2 h，使用ECL(美国Invitrogen)显影剂处理PVDF膜，置于凝胶成像系统(美国BIO-RAD)，检测目的蛋白条带，应用ImageLab软件计算目的蛋白表达水平。

五、统计学处理

结 果

一、肺腺癌中GASC1蛋白的表达

本研究对肺腺癌及癌旁组织进行了蛋白及mRNA相对表达量的检测，结果显示肺腺癌组织GASC1蛋白及mRNA相对表达量显著高于癌旁组织，差异具有统计学意义(P<0.001)(见图1、表1)。

图1 Western blot检测肺腺癌及相应癌旁组织中GASC1蛋白表达

二、免疫组化法检测GASC1蛋白的表达

免疫组化结果显示GASC1蛋白为棕黄色及棕褐色颗粒，主要位于肺腺癌细胞胞核，部分胞浆也有表达(图1)；且随着分化程度的降低(A：高分化；B：中分化；C：低分化)，免疫组化评分逐渐升高(见图2)。

图2 免疫组化检测肺腺癌组织中GASC1表达(400×)

图3 生存曲线

三、GASC1表达与肺腺癌临床病理特征的相关性

研究对GASC1蛋白相对表达量与肺腺癌临床病理特征的相关性，发现GASC1蛋白与分化程度、是否淋巴结转移、临床分期及生存显著正相关关系(P<0.05)，与性别、年龄、和吸烟无显著相关性(P>0.05)(见表2)。

表2 GASC1蛋白表达与肺腺癌临床病理特征的相关性

四、GASC1蛋白表达与肺腺癌患者预后

研究对100例术后肺腺癌患者进行随访，应用Kaplan-Meier绘制生存曲线并以Log-rank检验生存时间之间差异，患者术后随访时间36个月，生存时间为入院时间至最后一次随访日期或死亡，删失数据为随访至36个月仍存活的患者，未删失数据为由肺腺癌导致的死亡患者。结果显示，肺腺癌患者术后3年的总生存率为53.00%(图3)；GASC1阳性表达组3年生存率(33.33%)显著低于GASC1阴性组的3年生存率(67.24%)，差异具有统计学意义(Z=2.62，P<0.01)；GASC1阳性表达组的平均生存时间(21.55±2.10)显著低于GASC1阴性组(30.55±1.27)，差异具有统计学意义(t=26.63，P<0.001)(图3)。

讨 论

本研究是一项针对GASC1在肺腺癌预后中作用的大型前瞻性研究(肺腺癌标本共计100例)。研究结果显示，GASC1阳性患者的预后较差，并且与肺腺癌分期及术后癌转移相关，可以作为预后独立因素预测患者术后的生存质量。

本研究通过免疫组化检测，发现GASC1在肺腺癌细胞的细胞核高表达，为棕黄色及棕褐色颗粒，进一步检测其蛋白及mRNA的表达水平，均发现相比癌旁组织GASC1在肺腺癌组织中高表达，且与肺腺癌的转移相关，[10]。相关研究发现GASC1可通过H3K9去甲基化作用促进原癌基因NOTCHl、OCT4、NANOG等的转录，诱导细胞转化和促进肿瘤干细胞增殖[5, 11-12]。GASC1可与缺氧诱导因子(HIF-1a)结合，降低HIF-la的靶基因位点H3K9me3的表达水平，进而活化其下游靶基因，促进乳腺癌的转移[13]。此外，Luo等人在小鼠乳腺脂肪垫中注射MDA-MB-435癌细胞，对比GASC1基因正常组小鼠发现基因敲除组小鼠乳腺癌的进展被抑制。以上研究结果均表明GASC1可以调节组蛋白甲基化状态，进而调控癌症的侵袭和转移。

研究结果显示GASC1阳性患者的三年生存率显著低于GASC1阴性患者，提示GASC1可作为肺腺癌预后的独立预测因子，提示GASC1的高表达在肺腺癌中可以作为一个独立预后因子，评估患者术后的生存情况。与本研究结果类似，李娜等在食管癌的研究中发现GASC1阳性表达的食管鳞状细胞癌患者术后2年生存率为65.8%，而阴性表达者为86.4%，GASC1阳性患者的术后2年生存率显著低于GASC1阴性患者[14]。Liu等发现GASC1基因在乳腺上皮MCF10A细胞系中 9p23-24 区域扩增明显，诱导细胞永生化改变，使正常乳腺上皮细胞不依赖生长因子进行增殖，可作为参与干细自我更新的关键转录调节因子，诱导MCF10A细胞系形成乳腺球结构，增加了乳腺癌的侵袭、转移能力，导致癌变的发生[5]， 但Berdel 等在乳腺癌患者中却发现GASC1阳性患者的乳腺癌复发时间比GASC1阴性患者晚两年，且与更好的预后相关，对放射和激素治疗具有更好的敏感性[15]。这些研究结果提示我们下一步应继续研究GASC1介导肺腺癌发生发展的机制，明确GASC1蛋白在诱导肺腺癌侵袭发展中的作用。

综上所述，本研究显示GASC1阳性与肺腺癌的分化程度、淋巴结转移、临床分期和生存显著相关，GASC1高表达可能促进了肺腺癌发生发展的过程，可能是肺腺癌靶向治疗的潜在分子靶点之一。