动态监测诱导痰Tc1/Tc2比值在COPD患者中的临床价值

邹凡 赵云峰 刘明

慢性阻塞性肺病(chronic obstructivepulmonary disease , COPD)是一种以气流受限为特征的疾病状态，与肺对有害颗粒或气体，特别是香烟烟雾的异常炎症反应有关。长期吸烟引起的炎症被认为是慢性阻塞性肺病的重要发病机制之一。CD8+T淋巴细胞分为杀伤性T淋巴细胞(Tc)和抑制性T淋巴细胞(Ts)两类。Tc细胞亚群包括Tc0、Tc1和Tc2，其中Tc1主要分泌IFN-γ、IL-2，不分泌IL-4，而Tc2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，不分泌IFN-γ。目前稳定期COPD患者的研究发现在COPD炎症进展过程中Tc2细胞具有保护作用，Tc1细胞具有破坏作用，稳定期COPD患者存在Tc1/Tc2失衡。但对于急性加重期的COPD患者是否存在Tc1/Tc2失衡以及香烟烟雾对Tc1/Tc2平衡的影响，并未深入研究。本研究动态监测诱导痰中Tc1/Tc2比值及相关指标，探讨其在COPD患者中的临床价值。

资料与方法

一、一般资料

本研究是一项前瞻性队列研究，纳入2018年7月至2019年8月上海市浦东新区浦南医院呼吸内科病房收治的COPD(C级、D级)患者90例，其中男性64例，女性26例，年龄50-76(中位64.8)岁。入组标准：符合2018年GOLD指南[1]中COPD诊断标准。排除标准：(1)严重各器官功能不全，各组织器官或者系统恶性肿瘤，使用免疫相关的药品，除外合并相关的免疫缺陷疾病；(2)严重肺间质纤维化疾病，存在严重的组织器官感染；(3)近期发生过心肌梗死、脑卒中，近期进行过重大的手术等；(4)近期患有传染性疾病，或传染性疾病恢复期；(5)其他研究者认为不宜纳入的特殊人群。所有入组患者均签署知情同意书，本研究已通过上海市浦东新区浦南医院伦理委员会批准。

二、分组

根据吸烟状态不同，将COPD患者分为三组，不吸烟者为A组，戒烟者为B组，吸烟者为C组，每组各30例，A组男18例，女12例，中位年龄为67.5岁；B组男22例，女8例，中位年龄为64.8岁；C组男24例，女4例，中位年龄62.2岁。并随机选取10名健康者(不吸烟)作为正常对照组(D组)，四组研究对象在年龄、性别方面差异均无统计学意义(P>0.05)。A、B、C三组患者给予吸氧、抗感染、平喘及其他对症治疗。动态监测每组研究对象在入院时、出院时、出院6个月、出院12月的诱导痰中CD8+T淋巴细胞百分比、TC1/TC2比值以及肺功能，并记录入组患者1年内急性加重次数。

三、研究方法

1 诱导痰采用国际标准的诱导痰方法[2]，合格的痰标本标准：涂片检查每低倍镜视野见白细胞>25个，鳞状上皮细胞<10个，无唾液成分的痰液重量>1 g。如果细胞存活率低于50%和/或鳞状细胞污染超过20%，则认为标本不合格。痰液标本至少2 mL，加入0.1%二硫苏糖醇(Sigma, USA)，然后加入磷酸盐缓冲盐水(PBS)。 混合溶液进行过滤离心，得到的细胞再次溶于PBS中并准备进行下一步检测。

2 诱导痰中TC1与TC2检测 严格按照流式细胞仪的操作流程，应用流式细胞仪(Gallios机型，Beckman公司)检测，扩增细胞的操作是在37℃加湿环境下5小时，利用蛋白转运抑制剂布雷非德菌素A(Enzo Life Sciences)里面加入佛波豆蔻醋酸25 ng/ml (Enzo Life Sciences; PA, USA) 和离子霉素1 μg/ml (Enzo Life Sciences) 进行细胞扩增。利用扩增完后的细胞进行处理固定，采用抗IFN-藻红蛋白-7和抗IL-4-藻红蛋白鼠抗人抗体(eBiosciences)对细胞进行染色，用Kaluza软件分析，结果用CD8+T淋巴细胞的百分比以及Tc1/Tc2的比值进行表示。分泌IFN-γ的CD8+T淋巴细胞为Tc1细胞，分泌IL-4的CD8+T细胞为Tc2细胞。

四、统计学处理

结 果

一、随访期间各相关指标的比较

各组时间点测量值进行球行检验，P>0.05，满足“球对称”假设，目前国外研究也显示Tc1/Tc2比值等值与时间长短并未显示相关性。A、B、C组研究对象诱导痰中CD8+T淋巴细胞百分比、Tc1/Tc2比值、FEV1%的比值与D组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。A、B、C三组研究对象组间比较：三组入院时、出院时、随访1年后诱导痰CD8+T淋巴细胞百分比、Tc1/Tc2比值均有统计学意义(P<0.05)。A、B、C组研究对象组内比较：各组入院时诱导痰CD8+T淋巴细胞百分比、Tc1/Tc2比值均高于出院时和随访1年后，而各组入院时FEV1%低于出院时和随访一年后，差异有统计学意义(P<0.05)。A组与B组的FEV1%值在各时间点比较，差异无统计学意义(P>0.05)，C组的各时间点的FEV1%值低于A组与B组，差异有统计学意义(P<0.05)(见表1)。以上诱导痰中的数值均来源流式细胞分析(见图1、2)。

图1 流式细胞仪分析入院时各组诱导痰中Tc1/Tc2比值

图2 流式细胞仪分析出院时各组诱导痰中Tc1/Tc2比值

表1 4组研究对象诱导痰中相关指标及肺功能的比较

二、相关性分析

随访1年，A、B、C三组研究对象急性加重次数统计分析：数值范围(2～5次)，整体数据呈正态分布，A组：2.82±0.81次，B组：3.36±1.24次，C组：4.87±1.18次，两两比较均具有统计学差异(P<0.05)。A、B、C三组研究对象诱导痰中的Tc1/Tc2比值与FEV1%以及1年内急性加重次数的相关性研究显示：诱导痰中Tc1/Tc2比值与FEV1%呈负相关(P<0.05)，与COPD患者1年内急性加重次数呈正相关(P<0.05)(见表2)。

讨 论

COPD是一种具有不完全可逆的气流受限、进行性进展的慢性炎症性疾病，可累及到气道、肺实质和肺血管。吸烟是公认的引起COPD最重要的危险因素之一，香烟烟雾可以引起组织慢性炎症反应外，还可以使蛋白水解酶的活力增强、氧化应激水平增高、气道上皮细胞凋亡与增生的失衡[3-5]。

CD8+T淋巴细胞介导肺组织细胞死亡和组织损伤，在肺组织的炎症反应中，诱导痰中的指标较血液样本更准确以及重复性更好。在某些免疫炎症指标的检测中，肺泡灌洗液和血液样本会因为缓冲液等的稀释，诱导痰中的相关炎症指标较前两者高3～5倍。另外细胞学检测中，相较于全身来源的血液样本，诱导痰受相关炎症介导激活的有效细胞更高[6]。目前国内外已经出现一些对于稳定期COPD患者诱导痰中相关炎症指标的研究，但急性期以及动态监测CD8+T淋巴细胞水平则罕有报道。Anders Andersson等关于吸烟与COPD患者CD8+分子的相关研究中显示[7]：吸烟的COPD患者较非吸烟的COPD患者激活更多的CD8+T淋巴细胞。Cheng的研究也显示[8]：COPD患者的血液样本中CD8+T淋巴细胞的量与肺通气功能成负相关，CD8+T淋巴细胞在肺组织的浸润是一个全身性的炎症活动，而不仅仅存在于呼吸气道中。我们的研究显示：A、B、C三组研究对象组内比较时诱导痰中CD8+T淋巴细胞百分比入院时明显高于出院时、出院6个月及出院12个月。CD8+T淋巴细胞反映了COPD患者的炎症水平，介导了COPD气道炎症损伤的病理过程[9-10]，我们的研究结果与国外的研究结果一致。另外，在不同吸烟状态下的COPD患者诱导痰中CD8+T淋巴细胞百分比数据比较中发现，C组患者气道炎症水平明显高于A组、B组，说明在烟雾的刺激下，吸烟的COPD患者处于更高的CD8+T淋巴细胞介导的炎症免疫状态，对于气道、肺组织产生破坏，并在呼吸道感染等因素影响下，介导更严重的炎症反应。

表2 3组患者诱导痰Tc1/Tc2比值与有关指标的相关性分析

CD8+T淋巴细胞在COPD患者气道炎症中起着重要的作用。CD8+Tc的两个亚型为Tc1(产生IFN-γ)和Tc2(产生IL-4)，国外研究发现[11]：稳定期和急性期COPD患者中促炎CD8+T淋巴细胞以Tc1细胞为主，均高于健康非吸烟患者，而Tc2细胞在稳定期COPD患者中显著减少，吸烟能开启激活和扩增CD8+T淋巴细胞的“扳机点”。日本学者Toshihiro Shirai等[12]对稳定期COPD患者进行研究，结果显示：在COPD炎症进展过程中Tc2细胞具有保护作用，Tc1细胞具有破坏作用。Forsslund的研究更是指出[13]：吸烟能诱导降低Tc2细胞的表达水平。吸烟促进COPD患者的炎症加重，导致破坏性细胞增多与保护性细胞减少。COPD患者存在Tc1/Tc2细胞失衡，且是以Tc1爆发为主的慢性炎症性疾病。我们的研究显示：A、B、C组患者入院时，诱导痰CD8+T淋巴细胞百分比、Tc1/Tc2比值均高于出院时以及1年内各随访时间节点上数值，COPD的急性加重期与稳定期存在Tc1与Tc2两种细胞的不平衡分化，C组入院时CD8+T淋巴细胞百分比、Tc1/Tc2比值高于A组、B组，说明不同吸烟状态下的COPD患者气道也存在Tc1/Tc2失衡，这种免疫状态的不协调导致机体在抗击外来病原体的同时损伤了自身的组织细胞，大量Tc1细胞在肺和气道黏膜的局部聚集可能导致持续性慢性炎症。

Cheng[8]的研究显示香烟烟雾促进了CD8+T淋巴增殖并抑制其凋亡，同时促进调节T细胞的增殖和凋亡，其作用效果可以被毒蕈碱激动剂和拮抗剂所模拟。吸烟的作用类似于反复的病毒感染或其他的急性加重原因诱发或直接导致COPD患者的急性加重[14]。我们的研究显示：C组患者的FEV1%明显低于A组和B组，而急性加重次数则高于其他组。不同的吸烟状态影响COPD患者的通气功能以及急性加重次数。我们将诱导痰Tc1/Tc2比值与COPD患者肺功能指标及1年内急性加重次数进行相关性分析显示：诱导痰中Tc1/Tc2比值与患者的肺功能FEV1%呈负相关，与COPD患者1年内急性加重次数呈正相关性。COPD患者诱导痰中Tc1/Tc2比值增大、出现失衡能对COPD患者通气功能以及病情严重程度具有一定的预测作用。

综上所述，吸烟导致COPD患者气道呈现高的炎症水平，诱导痰中Tc1/Tc2失衡可能与COPD患者急性加重相关，可能作为一种新的生物学标记物用来评估COPD患者病情严重程度。本研究不足之处为单中心、小样本的临床研究，今后还需进一步设计扩大样本量、干预性的试验，并开展多中心、随机、双盲的对照研究，以进一步探讨诱导痰Tc1/Tc2失衡影响COPD患者急性加重的确切关系及内在机制。