富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体6通过Wnt/β-连环蛋白通路对结肠癌SW480细胞增殖、侵袭和凋亡的影响

王康，贾军梅，仇海乐，陈佩瑶，伊佳虹，张沙沙

作者单位：1山西医科大学，山西 太原030001；2山西医科大学第一医院肿瘤内科，山西 太原030001

在全球癌症发病率和死亡率排名中，结肠癌分别排在第三和第四位[1]。全球每年约有100 多万结肠癌新发病例，70 万结肠癌死亡病例[2]。目前临床上结肠癌的治疗主要以手术治疗为主，同时辅以放疗和化疗的综合治疗措施。由于早期结肠癌缺乏特异性特征，大多数患者发现时已处于中晚期，其五年生存率不到40%。因此寻找新的治疗方法和策略以提高结肠癌的治疗效果已成为临床研究的热点。基因治疗为癌症的治疗提供了一个新概念。明确结肠癌发生发展的生物学和遗传学特征可以为基因治疗提供新的证据[3]。

G 蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCR）是具有7 个跨膜域的膜蛋白，它们调节与多种疾病相关的各种生理过程［4］。富含亮氨酸重复序列的G 蛋白偶联受体6（LGR6）与LGR4 和LGR5 具有高度的同源性，它们在激活Wnt 途径中发挥作用［5］。有学者发现LGR6 是一组基底和腔内祖细胞的标志物，这些细胞诱导腔内乳腺肿瘤的发生［6］。LGR6在胃癌中升高，并与局部肿瘤生长相关［7］。转录组学分析结果显示，LGR6 在20%～50%的结肠癌病例中存在高甲基化［8］，然而其作用机制尚不明了。本研究自2019 年4—8 月通过下调结肠癌SW480 细胞LGR6 的表达，观察对结肠癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 结肠癌细胞株SW480 购自中国科学院（上海）典型培养库。

1.1.2 主要试剂及仪器 胎牛血清（批号20151206）及0.25%胰蛋白酶购自武汉普诺赛生命科技有限公司；Lipofectamine 2000 转染试剂（批号919437）和Trizol 反转录试剂盒（批号50175111）均购自武汉科昊佳生物科技有限公司；MTT 和Transwell 小室购自北京优尼康生物科技有限公司。LGR6 的小干扰RNA（LGR6 siRNA）序列购自上海吉玛制药技术有限公司。LGR6 阴性对照（LGR6 siCtrl）购自中国通用生物系统公司。二氧化碳细胞培养箱购自美国Forma Scientific 公司。4800型PCR仪购自美国Bio-Rad 公司。352 型酶标仪和DR2700分光光度计均购自美国HACH 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将SW480 细胞接种在含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基中，并在37 ℃和5%二氧化碳培养箱中培养过夜。第2天更换新鲜培养基并检测细胞密度。当细胞密度达到80% ～90%时，将细胞用0.25%胰蛋白酶消化并进行传代培养。

1.2.2 细胞转染 将处于对数生长期的结肠癌SW480 细胞制成单细胞悬液（密度为：2×105个细胞/毫升），并接种在6 孔板上，每2 天更换一次培养液。当细胞生长密度达到50%～60%时，将其分为实验组、阴性对照组和空白对照组。严格按照Lipofectamine 2000 的说明书要求，实验组细胞转染LGR6siRNA，阴性对照组细胞转染LGR6 siCtrl，空白对照组只转染试剂。处理后将细胞在5%二氧化碳培养箱中于37 ℃培养72 h［9］。

1.2.3 转染后细胞内LGR6 mRNA 表达水平 使用TRIzol 试剂（Invitgen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）从细胞中提取总RNA。使用cDNA 合成试剂盒（北京天根）合成cDNA。以根据制造商的方案使用SYBR-Green 进行qPCR 分析，反应系统包含2 μL cDNA，0.5 μL 正向引物（10 NM），0.5 μL 反向引物（10 NM），10 μL SYBR-格林缓冲液和7 μL 蒸馏水。使用ABI7500 进行数据收集。反应条件如下，50°C 2 min，95 °C2 min，95 °C15 s，60 °C 1 min。40 个循环。熔体曲线分析的条件为95 °C 15 s，60 °C 1 min和95°C 15 min。引物序列如表1所示。采用2-ΔΔCt法计算LGR6 mRNA的相对表达量。

表1 LGR6 mRNA和GAPDH引物序列

1.2.4 转染后细胞内蛋白表达水平 采用蛋白质印迹法（Western Blot）技术分别检测实验组和对照组LGR6 蛋白表达水平：制备培养细胞全细胞提取物，并使用RIPA 裂解缓冲液（上海碧云天生物技术研究所）进行蛋白印迹分析。用12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白（50 μg），并将其转移到聚偏氟乙烯膜上（美国EMD Milliperate）。用5%脱脂奶粉在室温下封闭膜1 h。加入一抗在4°C下孵育过夜。用PBS-Tween-20 洗涤3 次，每次10 min，加入山羊抗小鼠或山羊抗兔二抗在室温下孵育1 h。使用增强的化学发光Western印迹检测系统（Invitrogen）和X射线胶片对印迹进行显影。频带密度通过ImageJ 软件（美国马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院）进行鉴定。以GAPDH 作为内参，计算LGR6、Bax、Cleaved caspase 3、β-连 环 蛋 白（βcatenin）和c-Myc蛋白表达水平。

1.2.5 SW480 增殖活性检测 分别取实验组和对照组细胞悬液各100 μL（含约2 000 个细胞）置于96 孔培养皿中。每孔加入100 μL MTT 溶液，在细胞培养箱内继续孵育4 h。每孔加入100 μL Formanzan 溶解液，在细胞培养箱内再继续孵育。直至在普通光学显微镜下观察发现Formazan 全部溶解。记录570 nm处吸光度值。

1.2.6 Transwell 小室法检测结肠癌SW480 细胞侵袭 转染后72 h，将SW480 细胞用用无菌PBS 洗涤2 次，用无血清RPMI 1640 重悬，调整细胞浓度至1×106个/mL。将含有10%BSA 的RPMI 1640 培养液600 μL 加入24 孔板中，每个Transwell 小室加入200 μL 细胞悬液后放入24 孔板。每组做5 个复孔。常规培养24 h 后取出Transwell 小室，去除小室上室面细胞。并以95%的酒精固定小室约10 min，再以Giemsa 染液染色10 min PBS 冲洗后常温干燥。光镜下拍照，每个Transwell小室随机选10个视野光镜下拍照，取平均值进行统计。

1.2.7细胞凋亡实验 转染后72 h，将SW480 细胞用0. 25%胰蛋白酶（不含EDTA）消化收集，用PBS洗涤2 次，悬浮于500 μL Binding Buffer 缓冲液中，然后与5 μL Annexin V-FITC 混合，最后再加入5 μL PI 混匀，并在室温下反应10 min。采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0 统计软件分析，所有实验数据结果均以x ± s表示，多组均数的比较采用单因素方差分析，其中两两比较采用LSD-t 法，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SW480 细胞转染LGR6 基因结果比较qPCR分析显示，实验组、阴性对照组和空白对照组LGR6 mRNA 表达水平分别为（0.42±0.08）、（1.12±0.08）、（1.13±0.31），实验组LGR6 mRNA 表达水平显著降低（P ＜0.05）。Western-Blot 结果显示，实验组LGR6蛋白表达显著高于阴性对照组和空白对照组（P ＜0.05）；阴性对照组和空白对照组LGR6 蛋白表达水平差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图1。

图1 SW480细胞转染LGR6基因结果及Western-Blot结果比较：A为基因结果；B为Western-Blot结果

2.2 SW480 细胞增殖活性比较细胞活性检测结果显示，转染后24、48、72 h 时实验组细胞增殖活性（0.24±0.04）、（0.27±0.06）、（0.45±0.08）、（0.63±0.09）显著低于阴性对照组（0.22±0.03）、（0.40±0.05）、（0.92±0.07）、（1.32±0.11）和 空 白 对 照 组（0.26±0.04）、（0.42±0.07）、（0.94±0.09）、（1.21±0.12），均P ＜0.05，空白对照组和阴性对照组细胞增殖活性差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图2。

图2 结肠癌SW480细胞增殖活性

2.3 SW480 细胞侵袭能力比较Transwell 实验表明：实验组结肠癌SW480细胞侵袭细胞数为（42.38±6.12）×103个，阴性对照组组（94.21±16.54）×103个；空白对照组（97.76±18.24）×103个。实验组侵袭细胞数显著低于阴性对照组和空白对照组（P ＜0.05）。阴性对照组和空白对照组侵袭细胞数差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图3。

图3 结肠癌SW480细胞侵袭能力比较：A为两组Transwell图；B为两组侵袭细胞数比较

2.4 SW480 细胞凋亡水平比较细胞凋亡实验显示，实验组、阴性对照组和空白对照组细胞凋亡率（%）分别为（8.04±1.76）、（1.91±0.42）、（1.88±0.31），实验组结肠癌SW480 细胞凋亡率显著高于阴性对照组和空白对照组（P ＜0. 05）；空白对照组和阴性对照差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图4。

图4 结肠癌SW480细胞凋亡水平比较

2.5 SW480细胞Wnt/βcatenin相关蛋白表达水平比较转染后48 h，实验组Bax和Cleaved caspase 3蛋白表达显著高于阴性对照组和空白对照组和（P ＜0.05）；β catenin和c-Myc蛋白表达显著低于阴性对照组和空白对照组（P ＜0.05）。阴性对照组和空白对照组Bax、Cleaved caspase 3、β catenin和c-Myc蛋白表达水平差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图5。

图5 细胞内LGR6蛋白表达水平

3 讨论

结肠癌是一种恶性肿瘤，属于高致死性肿瘤之一［10］。随着中国经济的快速发展，结肠癌在中国的发生率也呈现逐年增加趋势，如今已成为中国高发的肿瘤之一，尤其在广东和上海等城市［11］。结肠癌的形成是一个逐渐发展的过程，是由多因素导致的综合性肿瘤，包括内源性因素和外部刺激等。环境因素诸如抽烟，喝酒均可能引起关键信号通路（如MAPK 信号通路和Wnt 信号通路等）的变化，进而引起结肠癌的发生。先前研究发现LGR6 在多种肿瘤中上调，如基底细胞样皮肤癌［12］和胃癌［13］。Ruan等［14］研究发现，沉默LGR6 的表达可通过抑制Wnt/β-Catenin 信号通路降低卵巢癌细胞的化疗耐药性。Wang 等［15］发现LGR6 的表达可作为结肠腺癌患者独立的预后指标。本研究实验组LGR6 蛋白表达显著高于阴性对照组和空白对照组。阴性对照组和空白对照组LGR6 蛋白表达水平差异无统计学意义，证明LGR6 siRNA 转染成功。转染后实验组细胞OD 值和侵袭细胞数均显著低于阴性对照组和空白对照组（P ＜0.05），细胞凋亡率显著高于阴性对照组和空白对照组，说明下调LGR6 可抑制结肠癌SW480 细胞增殖和侵袭，并促进细胞凋亡。与先前的研究一致。

Wang 等［16］研究发现LGR6 通过PI3K/AKT 通路促进HCT-116 和SW480结肠癌细胞的增殖和侵袭。Wnt/β catenin信号通路在调节多种类型肿瘤细胞增殖过程中发挥重要的作用，近90%结肠癌的发生都与此信号通路的激活有关［17］。有学者发现，激活Wnt/β catenin信号通路可导致β-catenin转运至细胞核，并激活下游靶基因如c-Myc、cyclin D1 等，从而参与结肠癌的发生和发展［18］。也有研究发现，Wnt/β catenin信号通路的抑制可抑制结肠癌细胞增殖并诱导凋亡［19］。尚无研究探讨LGR6 对结肠癌细胞Wnt/β catenin 信号通路的影响。本研究以Wnt/β catenin 信号通路为切入点，从另一方面探讨了LGR6 影响结肠癌发生发展的可能机制。结果发现，实验组细胞中促进凋亡诱导分子Bax 和Cleaved caspase 3蛋白表达显著高于阴性对照组和空白对照组，且Wnt 信号通路的关键分子β catenin 和下游靶基因c-Myc 的蛋白表达显著低于阴性对照组和空白对照组，说明下调LGR6 可能通过调节Wnt/βcatenin 信号通路而抑制结肠癌SW480 细胞增殖和侵袭，诱导细胞凋亡。

综上所述，LGR6 低表达可抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活，从而抑制结肠癌SW480 细胞的增殖和侵袭并促进细胞凋亡，抑制结肠癌的发生和发展。然而，尚需深入和系统的基础研究了解其具体机制与结肠癌肿瘤微环境之间的关系。