PRV自然感染仔猪后病毒在机体分布及gE基因序列分析

韩方方， 张红垒， 丁庆文， 刘红亮， 张燕， 魏战勇

(1．河南农业大学动物医学院，河南 郑州 450002；2.河南省动物性食品安全重点实验室，河南 郑州 450002；3.郑州大学生命科学学院，河南 郑州 450001)

猪伪狂犬病(Pseudorabies)属于疱疹病毒科，α-疱疹病毒亚科，水痘病毒属。是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV) 引起的多种家畜以发热、奇痒(猪除外)、繁殖障碍、脑脊髓炎为主要症状的一种高度接触性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为 B 类动物疫病，中国将其列为二类动物疫病[1]。现在已有40多个国家报道40多种动物感染该病,其中猪最容易感染，是其唯一的天然宿主及最主要的传染源[2]。妊娠母猪感染PRV后可产死胎及木乃伊胎，引起流产，新生仔猪主要表现为腹泻、衰竭和严重神经症状，其死亡率可达到100%[2-4]。PR在世界各国分布广泛，给养猪业造成的损失极为重大。PRV于1974年传入中国，至今在全国已经有30多个省份流行，是严重危害中国养猪业重要疫病之一。目前，对PRV分离株的致病性研究大多采用较大日龄的猪，而对仔猪的致病性研究及其在仔猪体内的分布情况报道较少[3-5]。有研究报道PRV能够引起100日龄猪的脑、肝脏和肺脏产生明显的组织病理变化，且在相应组织中有较高的拷贝数[6]。而PRV是否感染猪的肠道组织报道较少。本试验通过对河南省新郑某规模化猪场3只疑似为PRV感染病死仔猪进行病原的PCR检测及组织分布检测，并对其gE部分基因进行测序，与国内外其他参考毒株进行了序列比对分析，旨在为了解PRV在自然感染仔猪体内的分布情况、弄清近年来PRV的来源及与其他毒株的亲缘关系提供参考，以期为河南地区 PRV 的诊断和防控提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

河南省新郑某规模化猪场2018年11月份有2窝仔猪突然出现体温升高、身体发颤、呕吐及头转圈等神经症状，仔猪发病2 d后逐渐出现死亡，死亡率80%。发病送检的3只疑似为自然感染PRV发病死亡4日龄仔猪，发病仔猪3日龄表现为高热、拉稀、呕吐、共济失调、后驱瘫痪等急性症状。

1.2 主要试剂

DMEM培养液(武汉博士德生物公司)，DNA提取酚试剂(北京索莱宝公司)，DPEC水、氯仿、异丙醇(康为世纪公司)，TransZol试剂(全氏金生物公司)，75%乙醇(恩硕公司)，2×Taq Master MiX、反转录试剂盒(上海生物工程公司)，DNA Marker DL2000、MarkerⅠ，琼脂糖(Promega公司)，胶回收试剂盒(OMEGA公司)。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank上已经登录的猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritis of swine TGEV)、猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)的基因组序列，应用Primer Premier 5.0基因分析软件分别设计了5对特异性检测引物和1对PRV的gE基因特异性扩增引物，引物送至郑州擎科生物科技公司合成。相关引物序列信息见表1。

1.4 病原的检测

1.4.1 病料的采集与处理 首先需对病死仔猪进行病原检测，取其肝、脾、脑组织和肠系膜淋巴结适量混合研磨，移入适量DMEM培养液混合制成组织匀浆，用微量加样器将混合组织匀浆移入干净的EP管内，12 000 r·min-1离心10 min(Eppendorf 4 ℃离心机)。然后取上清液并分装放入-40 ℃冰箱保存备用。然后进行该病死仔猪各组织器官内病毒的分布检测，分别取其心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、大肠、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结和脑组织，处理方法及保存同上。

表1 相关引物序列信息Table 1 Relevant primer sequence information

1.4.2 DNA提取及PRV的检测 采取SDS-Protein K法提取混合组织样品DNA，置于-20 ℃冰箱保存备用。以提取的DNA作为模板，用PRV检测引物T1/T2进行PRV的检测，PCR扩增体系见表2，扩增程序见表3。取6 μL PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，然后在紫外凝胶成像系统下判断结果。

表2 PCR扩增体系

表3 PCR扩增程序Table 3 Programming of PCR amplification

1.4.3 RNA的提取及PEDV、TGEV、PDCoV、PRRSV的检测 用Trizol试剂提取混合组织样品RNA，按照Vazyme反转录试剂盒说明书进行反转录以合成cDNA，反应体系为20 μL，操作方法为：向EP管中加入Oligo(dT)23VN 1 μL，Total RNA 7 μL，在65 ℃恒温水浴锅内加热5 min，然后迅速放在冰上静置2 min；加入 HiScript Ⅱ Enzyme Mix 2 μL ，2×RT Mix 10 μL，用微量加样器轻轻地吹打混匀，然后用封口膜封住EP管口，保证密封；反应程序设置50 ℃，45 min；85 ℃，2 min；获得产物cDNA可立即用于进行PCR反应或放置在-40 ℃冰箱保存。

以上述方法得到的cDNA为模板进行PEDV、TGEV、PDCoV、PRRSV的检测，PCR扩增体系同及扩增程序同表2、表3。根据PEDV引物T3/T4、TGEV引物T5/T6、PDCoV引物T7/T8、PRRSV引物T9/T10需要的退火温度不同，分别为58、54、56和53 ℃，由此，需将表3中退火温度设定为53～58 ℃的退火温度梯度。取6 μL PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，然后在紫外凝胶成像系统中拍照判断结果。

1.5 病原的各组织分布检测

以1.4.2同样的方法提取所采集的各组织器官的DNA作为模板，用PRV检测引物T1/T2进行PRV于各组织器官的分布检测，PCR扩增体系及扩增程序同表2、表3。同时设置2个对照组，以保证试验结果的准确性。

1.6 组织病理学检测

采集发病仔猪和正常仔猪的新鲜心脏，肝脏，脾脏，肺脏和肾脏组织，迅速固定，经脱水透明、浸蜡和包埋，制作组织切片，用苏木素-伊红法(HE)染色后，置于XD-202倒置生物显微镜(南京江南永新光学有限公司)下观察。

1.7 gE基因的扩增与鉴定

以混合组织样品DNA为模板用PRVgE基因扩增引物P1/P2进行PRVgE基因的扩增，PCR扩增体系及扩增程序同表2、表3，将表3中退火温度设定为58 ℃。 PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，目的片段经胶回收后送至郑州擎科生物科技有限公司进行测序鉴定。

1.8 gE基因序列分析

用DNAStar7.1中的MegAlign软件对测序结果与GenBank上发表的20条国内外PRV参考毒株gE基因的序列进行核苷酸及其推导的氨基酸序列同源性分析，并绘制遗传进化树。参考毒株信息见表4。

2 结果与分析

2.1 病原的检测结果

以提取的混合组织样品DNA和cDNA为模板，分别用PRV、PEDV、TGEV、PDCoV、PRRSV 5种病毒的特异性检测引物进行PCR扩增，结果见图1。只有PRV扩增出l条清晰条带，大小与预期的273 bp结果相符，其余4种病毒均未扩增出条带。初步结果表明，3头仔猪均感染猪伪狂犬病病毒。

表4 参考毒株信息

2.2 病原的各组织分布结果

以提取的仔猪各组织器官DNA为模板，用PRV检测引物T1/T2进行扩增，将心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、大肠、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结和脑组织的PCR产物分别加入用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，结果见图2。结果表明，该发病仔猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肠系膜淋巴结、脑组织和阳性对照均出现与PRVgE基因一致的大小为273 bp的片段，显示为PRV阳性；肾脏、小肠、大肠、腹股沟淋巴结和阴性对照无目的片段。说明PRV在该自然感染仔猪体内具有比较广泛的组织嗜性。

M:DL2000 Marker; 1～5:PRV、PDEV、TGEV、PDCoV、PRRSV 5种PCR产物;N:阴性对照。

M:Marker Ⅰ;1 ～10: 心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、大肠、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结和脑组织的PCR产物;N:阴性对照;P：阳性对照。M: Marker Ⅰ;1 to 10: PCR products of heart, liver, spleen, lung, kidney, small intestine, large intestine, mesenteric lymph node, inguinal lymph node and brain tissue; N: Negative control; P: Positive control.图2 PRV在仔猪各组织的分布

2.3 组织病理学检测结果

对采集的发病仔猪和正常仔猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织经组织病理学检查发现，与对照组相比，自然感染PRV组的心脏，肺脏和肾脏组织没有明显的组织病理学变化，而肝脏、脾脏组织炎性细胞显著增多(图3)。

图3 PRV自然感染仔猪的组织病理学变化

2.4 gE基因扩增与鉴定结果

将组织样品DNA进行PRVgE基因的PCR扩增，结束后进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，结果得到约430 bp的片段，与预期结果相符(图4)。目的片段经胶回收后由郑州擎科生物科技公司进行测序鉴定。测序结果显示，该基因片段的大小为383 bp，编码128个氨基酸，说明该发病仔猪为PRV野毒感染。

M:DL2000 Marker;1:PRV gE基因PCR产物。

2.5 gE基因序列分析结果

为便于将所测的gE基因序列与GenBank中已发表的 PRV 毒株的基因序列进行同源性比较分析，将检测到的 PRV 命名为PRV HNZZ01。将测序的结果与GenBank中已经登录的其它20株PRVgE基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行分析比对，结果显示，PRV HNZZ01的gE部分基因序列和参考毒株的核苷酸序列的同源性在98.2%～99.5%。其中与国内Ea、GDSH、Guizhou-DY、HBCL-2012、LXB6、SC、Xiang A株和韩国Yangsan株的同源性最高为99.5%,与国内Guangdong株的同源性最低为98.2%，与欧美国家Becker、Kaplan、Nia-A、Rice等经典毒株的同源性相对比较低，为98.7%～99.2%。核苷酸的多序列比对结果表明，不同株之间gE基因的核苷酸序列中存在许多碱基的替换，主要在G-A和T-C之间。PRV HNZZ01株gE部分基因核苷酸序列在314位和383位出现了明显的碱基突变，314位由G→A，383位由C→T(图5)。

PRV HNZZ01gE部分基因序列和参考毒株推导的氨基酸序列的同源性在97.6%～100%,其中与国内Ea、GDSH、Guizhou-DY、HBCL-2012、LXB6、SC、Xiang A株和马来西亚P-Prv株、韩国Yangsan株的同源性最高为100%,与国内Guangdong株的同源性最低为97.6%，与欧美国家Becker、Kaplan、Nia-3、Rice等经典毒株同源性相比较低，为98.4%～99.2%。推导的氨基酸多序列比对的结果显示，欧美Becker、Kaplan、Nia-3、Rice等经典毒株与国内毒株编码的氨基酸序列相比，第8位由亮氨酸(L)变为丝氨酸(S)(图6)；PRV HNZZ01gE基因编码的氨基酸序列在第128位由丝氨酸(S)变为苯丙氨酸(F)(图7)。

图6 PRV HNZZ01与参考毒株gE部分基因推导的氨基酸序列比对

图7 PRV HNZZ01与参考毒株gE部分基因推导的氨基酸序列比对

在PRV HNZZ01和GenBank中已登录的20株PRV参考株gE基因部分核苷酸相似性基础上做了遗传进化树的分析(图8)。结果显示，gE基因的遗传进化树明显分成了2个大群。其中，中国、马来西亚和韩国处于一个大的亚群，组成一个亚洲株进化群；欧洲和美洲的毒株处于另一个大的亚群，组成一个欧美株进化群。PRV HNZZ01株处于亚洲毒株进化群;并且与国内经典毒株的亲缘关系较近，与国外毒株的亲缘关系较远。

图8 PRV HNZZ01 gE基因的遗传进化树分析Fig.8 Genetic and evolutional tree analysis of gE gene of HNZZ01

3 讨论

2012年以来，中国许多地方伪狂犬病疫情日益严重，给养猪业带来了极大的影响。并且许多地区分离得到新的PRV变异毒株，变异株的毒力明显增强[6-10]。这表明，PRV毒株正在往新的高致病力方向进化。有研究表明，当前生产上使用的弱毒疫苗接种后不能对猪群提供有效的保护，无法帮助猪群抵御新流行毒株的攻击[11-13]。PRV的gE糖蛋白虽然不是病毒复制的必须蛋白，但该蛋白缺失后能极大减弱病毒的毒力[14]。近年来,gE基因的变异成为中国PRV新流行株的分子特征之一[15-16]，所以选择对gE基因序列进行比对分析。

本研究采用普通PCR抗原检测方法及gE部分基因扩增和序列分析等方法，检测证实该病死仔猪感染PRV野毒。并对该病死仔猪进行PRV各组织器官定性分布检测，结果显示，在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肠系膜淋巴结和脑组织中均检测到了PRV，这与龙晓婷等[17]、郭丽静等[18]的研究结果大致相一致，不同之处是他们采用的是人工攻毒30日龄的猪，且能够引起肾脏显著的病理变化，而本研究在肾脏组织没有检测到病原的存在，研究结果进一步说明PRV在该自然感染仔猪体内分布较广，具有比较广泛的组织嗜性。

将PRV HNZZ01与其他20株参考毒株gE部分基因序列比较分析，结果显示，gE基因核苷酸序列在314位和383位出现了明显的碱基突变，314位由G→A，383位由C→T，同时编码的氨基酸序列与参考毒株相比在第128位由丝氨酸(S)变为苯丙氨酸(F)。以上表明该毒株可能是gE基因序列中个別氨基酸位点发生了突变，使PRV病毒抗原发生了变异，从而使PRV毒力增强，以致现有的疫苗不能够发挥理想的免疫保护作用，这也许是引起当前PRV疫情流行的主要原因。该突变对PRV的毒力强度及是否会影响中和抗体的产生有待进一步的研究。遗传进化树分析的结果显示，PRV HNZZ01与国内Ea、GDSH、Guizhou-DY、SC等经典毒株的亲缘关系最近，与欧美毒株的亲缘关系最远，说明检测的PRV HNZZ01应该来源于国内经典毒株，但部分基因发生了变异。

综上所述，PRV在该自然感染仔猪体内具有比较广泛的组织嗜性，PRV HNZZ01应该属于变异毒株，其分子特征可为河南地区变异株的分子流行病学的调查提供重要参考，以便更好地对猪伪狂犬病的防控提供科学依据。