基于膜技术的地黄根区土壤化感物质分离效果研究

孙香荣， 李娟， 钮颜宇， 郭志祥， 李连珍， 齐辉， 杜家方， 张重义,2

(1.河南农业大学农学院，河南 郑州 450046； 2.福建农林大学作物科学学院，福建 福州 350002)

地黄(Rehmanniaglutinosa)为玄参科地黄属多年生草本植物，以新鲜或干燥块根入药，具有重要的药用价值和经济价值[1]。地黄在生产中存在严重的连作障碍问题，早在明清时期的《本草乘雅半偈》就有记载[2]。其地上部分生长较小；地下块根多形成毛根或须根，产量降低；块根有效成分积累量降低，质量下降；土壤病虫害严重，块根变黑腐烂等。

化感自毒作用是引起地黄连作障碍的主要因素[3]，化感自毒物质的准确筛选及生态功能验证是目前的研究瓶颈之一。随着色谱及质谱鉴定技术的发展，研究者们利用GC-MS，HPLC-MS等方法从地黄根际土壤中检测出酚酸类、脂肪酸类、环烯醚萜苷类和苯乙醇苷类化合物等几十种潜在化感物质[4-6]。由于根系分泌物的大量收集和分离难度较大，目前对于上述化感物质的验证，仍主要依靠生物测试的方式[7]。土壤微生态系统极为复杂，要较准确地评价化感物质的化感潜力必须进行田间试验。而由于化感物质间的协同、拮抗等交互作用及剂量效应的存在，即使能分离或合成化感物质单体，其生态功能验证仅靠简单的外援添加试验也不准确。基于此，研究者提出了将基于目标成分“敲出”的药效辨识模式的方法用以筛选植物化感物质的思路[8]，而大量的富集和分离土壤提取物则是这一技术的前提。

膜分离技术是近代兴起的一项绿色工业分离新技术，其以选择性透过膜为分离介质，根据混合物的理化性质的不同，在压力差、浓度差等因素推动下，使原料得以被分离、提纯和浓缩[9]。主要的膜分离技术有微滤膜、超滤膜、纳滤膜、反渗透膜、集成联用技术、分子印迹复合膜、膜蒸馏技术等[10]。其分离效率高，操作的温度和压强较低，适合生物活性物质的分离，可最大限度地保存产品的生物活性，且耗能低，使用方便，操作简单。本研究将膜分离技术应用到对土壤中化感物质的富集工艺研究中，通过膜分离实现化感物质的过滤、除杂、富集，并结合盆栽试验进行验证，为研究地黄化感自毒物质及其化感效应提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤样品的采集 试验所用土壤取自河南农业大学许昌校区试验田，包括2017年的地黄试验地(根区土)和试验地附近10 a内未种植过地黄的土壤(对照土)。根区土壤的采集在地黄采收时进行，在采挖地黄时，收集其地下5～20 cm的根区土壤，将采集的土样去除石块和植物根系等杂质，置于阴凉通风处自然干燥，过50目筛后储存备用。

1.1.2 供试品种 供试品种为地黄‘温85-5’品种，由河南省温县农业科学研究所提供，经河南农业大学高致明教授鉴定为地黄(Rehmanniaglutinosa)。选择生长健壮无病虫害，直径为2～3 cm的地黄块茎作为种栽段，种前用80%多菌灵可湿性粉剂500倍液浸泡30 min。

1.1.3 膜的选择 根据前人从地黄及其根区土壤中分离出的化感物质的相对分子质量[5,11]，分别选用了孔径为0.2 μm微滤膜元件、截留相对分子质量为5 000和150 D的超滤膜和纳滤膜元件及反渗透膜元件作为试验材料，各膜元件的工作参数见表1。

1.1.4 仪器 卷式膜小型分离实验机(BONA-GM-19、济南博纳生物技术有限公司)、离心机(TDZ5-WS、湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)、超声波清洗器(KQ5200DE、昆山市超声仪器有限公司)、手持式SPAD叶绿素仪(SPAD-502Plus、柯尼卡美能达控股公司)、电导率仪(IS228BASIC、上海仪迈仪器科技有限公司)、高效液相色谱仪(Waters 2489、Waters公司)、根系扫描仪(WinRHIZO Manual 2013，爱普生(中国)有限公司)、人工气候箱(PQX-330A-2013、宁波莱福科技有限公司)、循环水多用真空泵(SHB-3、郑州杜甫仪器厂)、旋转蒸发仪(RE-52AA、上海亚荣生化仪器厂)、50目药典筛(GB/T 6003.1—1997、新乡市同心机械有限责任公司)等。

表1 滤膜工作参数Table 1 Operating parameters of the filter membrane

1.1.5 试剂 甲醇为色谱纯(DIKMA公司生产)，对照品：香豆酸(批号500-05-0，北京百灵威科技有限公司)、香草酸(批号10776-200402，中国药品生物制品检定所)、丁香酸(批号530-57-4，Acros Organics)、对羟基苯甲酸(批号99-96-7，上海源叶纯生物技术有限公司)、阿魏酸(批号537-98-4，上海源叶纯生物技术有限公司)，冰乙酸(批号64-19-7，Aladdin Industrial Corporation)、多菌灵(PD20090355、山东恒越化工产品有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 地黄根区土中化感物质的提取 将预处理过的地黄根区土壤，分别装入容器，共加入土样量6倍的蒸馏水，分3次进行超声提取，每次30 min，经过离心，抽滤除杂，取上清液。另取试验地附近10 a内未种植过地黄的土壤，用同样的方法提取化感物质作为对照。

1.2.2 地黄根区土壤水提液的富集与浓缩 利用卷式膜分离系统，分别通过微滤膜、超滤膜、纳滤膜、反渗透膜进行浓缩，得到4种不同分子段截留的浓缩液。将获得的对照土壤的水提液也分别通过微滤膜、超滤膜、纳滤膜、反渗透膜进行浓缩，得到4种不同分子段截留的浓缩液，备用。

1.2.3 地黄根区土壤水提液富集效率的测定 分别取4种不同的截留液各50 mL，溶液置于蒸发皿中，充分蒸干其中的水分，测量剩余物质的含量，并计算其质量浓度；同时根据试验用土总量及质量浓度，计算其富集效率，其计算公式为：

1.2.4 不同截留液中的酚酸类化感物质含量测定

1.2.4.1 混合对照品溶液的制备 分别精密称取香豆酸、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸和阿魏酸对照品各1 mg，加色谱甲醇溶解并定容至1 mL容量瓶，即得质量浓度为1 g·L-1香豆酸、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、阿魏酸混合标准品溶液。置于冰箱中冷藏，备用。进样时取混合标准品溶液稀释到质量浓度为0.125 g·L-1，过0.22 μm微孔滤膜。

1.2.4.2 供试样品溶液的制备 将上述1.2.2项下得到的不同分子直径的截留液各500 mL，置旋转蒸发仪上55 ℃减压蒸发浓缩，直至观察不到水分，加甲醇溶解定容至2 mL，摇匀避光，4 ℃保存，备用。待测液测试前过0.22 μm滤膜。

1.2.4.3 色谱条件 仪器为Waters 2489；色谱柱为Sun Fire TMC18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；检测波长280 nm；流速1 mL·min-1；进样量20 μL；柱温28 ℃；甲醇(A)-0.2 %冰乙酸水(B)系统，梯度洗脱(0～16 min，15%～20%甲醇；16～32 min，20%～32%甲醇)。

1.2.5 不同截留液的化感效应测试 将从22.34 kg地黄根际土壤中得到的4种截留液各500 mL，分别拌入对照土中，混合均匀，用10 cm×10 cm方盆栽种预先处理过的地黄块根，另设对照土和根区土的土壤种植作为对照，每个处理重复6次，后期采用常规管理方式。

1.2.6 地黄苗期生长及生理指标的测定 在苗期进行取样测定，叶绿素含量用手持式SPAD叶绿素仪进行测定；电导率的测定是根据苍晶等[12]植物组织逆境伤害程度的测定的方法，因地黄叶片上有绒毛，把抽真空时间改为20 min；根系活力测定采用甲烯蓝染色法；根系形态特征用根系扫描仪对根部进行扫描。

1.2.7 统计分析 试验数据采用Excel 2011和SPSS 25.0进行统计分析和制图，采用Duncan’s新复极差法进行差异显著性检验(P=0.05和P=0.01)。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 线性关系考察 设置酚酸混合对照品溶液进样量为1,2,4,6,8,12,16,20 μL，按“1.2.4.3”项下条件测定，以进样量为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得线性回归方程如表2所示。

表2 5种酚酸的标准曲线Table 2 Standard curves of 5 phenolic acids

2.1.2 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液，按“1.2.4.3”色谱条件重复测定 6 次，记录峰面积并计算RSD值，得到香豆酸、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸和阿魏酸的色谱峰面积的RSD分别为0.037 6%，0.010 8%，0.020 8%，0.002 9%，0.003 5%。

2.1.3 稳定性试验 将纳滤膜截留液在制备后放置 0，2，4，6，8，10 h，按“1.2.4.3”色谱条件进行定量分析，测得香豆酸、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸和阿魏酸在不同时间色谱峰面积的RSD值为 0.192 1%，2.538 9%，1.117 7%，1.343 1%，3.525 7%。

2.1.4 重复性试验 将纳滤膜截留液按“1.2.4.3”色谱条件重复测定6次进行定量分析，计算分析得到香豆酸、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸和阿魏酸含量的RSD值分别为0.0861%，2.6175%，1.223 8%，1.355 5%，3.469 01%。

2.2 不同膜元件对地黄根区土壤水提液富集效率的影响

将预处理过的地黄根区土壤水提液通过不同分子大小的卷式膜之前，测其pH值为6.47，总干物质质量浓度为2.78 g·L-1，经过不同分子段的卷式膜后，各分子段滤膜截留后溶液的质量浓度如表3所示，其富集效率：纳滤膜 >反渗透滤膜 >微滤滤膜 >超滤滤膜。纳滤膜对根区土壤水提液的富集效率最高，纳滤膜可以截留50%的无机盐离子、低聚糖、多价离子等直径在0.001 μm以上的物质，而能透过膜的只有一些相对分子质量很小的物质及部分无机盐离子。

表3 不同膜元件对地黄根区土壤水提液富集效率的影响Table 3 Effect on enrichment effiency of soil water extracts from root zone of Rehmannia glutinosa by different membrane elements

2.3 不同膜元件截留液中的酚酸类化感物质分析

由表4可知，地黄根区土提取液的不同分子直径截留液中均检测到酚酸类化合物(图1)，但酚酸类化合物的种类和含量相差很大，微滤膜截留液和纳滤膜截留液中的酚酸类物质种类最多，含量也较高。其中，纳滤膜截留液中的5种酚酸的含量最高，与其富集效率相一致；而微滤膜在本试验中主要起到过滤分离固体颗粒的作用，其截留液中存在较多的酚酸类物质，可能与土壤提取液中固体颗粒的吸附效应有关。在本试验中，对照土中每种截留液都检测到阿魏酸，且含量高于试验组。据调查，取样土壤在近2 a内种植过小麦，在撂荒的年份，地里蒲公英、青蒿、牵牛、苍耳、益母草等杂草的密度比较高。蒲公英[13]、牵牛[14]、苍耳[15]植物及种子中都能检测出5种酚酸类物质中的阿魏酸。蒲公英中还检测出对羟基苯甲酸、丁香酸。这些植物残体在土壤中的分解，可能是导致阿魏酸含量偏高的原因。

注：A.5种酚酸标准品HPLC色谱图；B.微滤膜截留液；C.超滤膜截留液；D.纳滤膜截留液；E.反渗透滤膜截留液；1.香豆酸；2.对羟基苯甲酸；3.香草酸；4.丁香酸；5.阿魏酸。

2.4 地黄根区土壤水提液不同截留段的化感效应分析

2.4.1 根区土壤水提液不同截留段对盆栽地黄地上地下鲜质量的影响 地黄地上地下鲜质量由图2所示。添加根区土壤水提液不同截留液对地上部分鲜质量的影响，地上部分鲜质量为对照土>根区土>反渗透滤膜截留液>纳滤膜截留液 >超滤膜截留液>微滤膜截留液，地上部分各处理之间无显著性差异；添加根区土壤水提液不同截留液对地下部分鲜质量的影响，地下部分鲜质量为对照土>反渗透滤膜截留液>微滤膜截留液>纳滤膜截留液>超滤膜截留液>根区土，地下部分对照土与其他处理之间存在显著性差异，其他各组之间无显著性差异。

表4 不同分子直径截留液中5种酚酸含量Table 4 The contents of 5 phenolic acids in the interception fluids with different molecular diameters

注:图中数据为平均值±标准误。大、小写字母分别表示不同处理间P=0.01，P=0.05水平下差异显著性。下同。

2.4.2 根区土壤水提液不同截留段对盆栽地黄根系形态的影响 由地黄根系扫描结果(表5，图3)可以看出，从总投影面积上分析，反渗透膜截留液和微滤膜截留液与对照土无显著差异，纳滤膜截留液和超滤膜截留液与对照土在P=0.05水平上有显著差异，纳滤膜截留液和超滤膜截留液与根区土无显著性差异，反渗透膜截留液和微滤膜截留液与根区土在P=0.05水平上有显著差异。说明纳滤膜截留液和超滤膜截留液对地黄生长有一定的影响；根系的平均直径各组分间均无显著性差异，但对照土>超滤膜截留液>根区土>反渗透膜截留液>纳滤膜截留液 >微滤膜截留液；反渗透膜截留液组根系的平均体积与对照土无显著性差异，而微滤膜截留液、超滤膜截留液、纳滤膜截留液与对照土在P=0.05水平上有显著差异，各组分与根区土之间均无显著性差异。说明微滤膜截留液、超滤膜截留液、纳滤膜截留液均对地黄根系生长有一定的影响。从根尖数上分析，超滤膜截留液组的根尖数偏小，与对照土之间在P=0.05水平上有显著性差异，其他各组之间无显著性差异，而各组分与根区土之间也无显著性差异。说明各超滤膜中所含组分可能会影响地黄根系分支。

2.4.3 根区土壤水提液不同截留段对盆栽地黄叶绿素相对含量的影响 由图4可知，添加根区土壤水提液不同截留液对地黄叶片叶绿素相对含量的影响为对照土>超滤膜截留液>反渗透滤膜截留液>根区土>纳滤膜截留液>微滤膜截留液，各组分之间在P=0.01水平上均无显著差异，根区土组合微滤膜截留液组与对照土在P=0.05水平上有显著差异，其他各组分与对照土间无显著差异。由图4可知，与对照土比，添加了超滤膜截留液的叶绿素相对含量最高，可能超滤膜截留液中对地黄生长不利的化感物质极少；添加了微滤膜截留液的叶绿素含量最低，可能是微滤膜截留液中的微生物在土中影响地黄的生长。

表5 地黄根系扫描分析结果Table 5 The results of root scanning analysis of Rehmannia glutinosa

注：CK.对照土；A.根区土；B.微滤膜截留液；C.超滤膜截留液；D.纳滤膜截留液；E.反渗透滤膜截留液。

图4 添加根际土壤水提液不同截留段的盆栽

2.4.4 不同截留段根区土壤水提液对盆栽地黄叶片细胞膜透性的影响 植物叶片相对电导率是反映植物细胞膜透性的一项基本指标。当植物受到逆境环境影响，细胞膜遭到破坏，膜透性增大，其电导率也会随之增大。由图5可知，添加根区土壤水提液不同截留液对地黄叶片细胞膜透性影响为根区土 >纳滤膜截留液 >对照土 >微滤膜截留液 >反渗透滤膜截留液 >超滤膜截留液，各组之间无显著性差异。

图5 添加根际土壤水提液不同截留段的盆栽地黄相对电导率比较Fig.5 Comparison of the relative conductivity of potted Rehmannia glutinosa with different interception sections of rhizosphere soil water extract

2.4.5 根区土壤水提液不同截留段对盆栽地黄根系活力的影响 由图6可知，添加根区土壤水提液不同截留液对地黄的根系活力影响为对照土>超滤膜截留液>根区土>反渗透滤膜截留液>微滤膜截留液>纳滤膜截留液，各试验组之间均存在显著性差异，其中，添加了超滤膜截留液提取物的盆栽地黄的根系活力相对最高，而添加了纳滤膜截留液提取物的盆栽地黄的根系活力最低，这也与不同截流段的物质酚酸类化感物质分析结果相吻合。说明在纳滤膜截留液中存在的化感物质可降低地黄根系活力。

图6 添加根际土壤水提液不同截留段的盆栽地黄根系活力比较Fig.6 Comparison of root activity of potted Rehmannia glutinosa with different interception sections of rhizosphere soil water extract

3 结论与讨论

本试验以地黄及其种植地根区土壤为研究对象，使用卷式膜法对其土壤水提液进行浓缩，用微滤膜分离固体微粒超滤膜除去大分子物质，再用纳滤膜和反渗透膜浓缩收集小分子物质及无机盐离子，已达到初步分离和富集的效果。

试验对不同膜通量进行了比较，结果表明，在膜通量为125 mL·min-1时即可高效率进行浓缩，30 L的水提液可以在8 h内完成浓缩工作，大大节省了时间，具有分离精度高、能耗低等优势[16]。卷式膜小型分离实验机在使用过程中温度<40 ℃，可避免一些热敏感物质的分解，同时卷式膜的pH值在3.0～10.0耐受范围广，有利于化感物质的富集。

本试验还以酚酸类化感物质为指标，采用HPLC检测方法，对卷式膜的分离结果进行了分析。结果表明，在纳滤膜截留液中化感物质的种类和含量最多，土壤环境的复杂性决定了化感物质种类的多样性，也决定其相对分子质量的差异性，已知的化感物质，如酚酸类化合物、环烯醚萜苷类化合物和苯乙醇苷类化合物等的相对分子质量一般都在1 000 D以下，从本研究选用的不同分子直径卷式膜的富集结果也可以看出，截留相对分子质量在150 D～5 000 D纳滤膜截留液的化感物质的种类和含量均最多；而在对照组中检测到含量很少的丁香酸，基本上都是阿魏酸，物质较单一，在盆栽试验中也几乎无连作现象，这也与外源添加酚酸类物质模拟地黄连作障碍结果[17-18]相对应。表明引起连作的因素错综复杂，但不是某种单一酚酸的绝对浓度，而是多种酚酸相互作用造成的。

本试验同时采用盆栽试验，在未种过地黄的土壤中分别添加不同截留段的根区土壤水提液，通过研究其对地黄的连作障碍效应，来检测卷式膜对地黄化感物质的分离及富集效果。对照组与各试验组的生长及生理指标分析比较结果表明，添加了纳滤膜截留液的地黄不论在生长指标或是相对叶绿素含量、根系活力、相对电导率等生理指标方面均表现出较强的连作障碍效应，说明不利于地黄生长的化感物质主要保留在纳滤膜截留液中，导致地黄生长能力下降。

本试验使用卷式膜法处理根区土壤水提液以达到分离纯化和浓缩化感物质的目的，试验结果显示，此方法可以快速、便捷地分离浓缩土壤水提液，为后期的化感物质分离及化感物质的田间试验创造了条件。但是，卷式膜在使用过程中有浓差极化和膜污染的问题，这会影响分离效率和膜的使用寿命，也增加了应用设备投资的成本，在一定程度上限制了其发展。目前报道在应用中使用的大多还是通用型的纳滤膜材料[19]，缺乏提纯某些单物质专用纳滤膜材料。但随着对上述问题的深入研究，该技术在化感物质分离的研究中的应用前景会越来越广阔。