宛艾多酚类物质的提取工艺优化及组分分析

詹永， 廖霞， 杨勇， 罗杨， 徐丽娟

(1.重庆市中药研究院，重庆 400065； 2.中药健康学重庆市重点实验室，重庆 400065； 3.云南民族大学，云南 昆明 650031)

艾叶为菊科植物艾(ArtemisiaargyiLevl.et Vant.)的干燥叶，是中国传统中药，常用于炎症、瘟疫、出血、皮肤瘙痒、经寒不调和肺结核等疾病的预防治疗[1]。艾叶在中国资源丰富，以河南省、湖北省和湖南省产量较多，但不同产地艾叶质量参差不齐。河南省南阳市是医圣张仲景的故乡，艾草输出量大、质量好，以“艾草之乡”享誉国内外，故产于此地的艾草称为宛艾[2-3]。宛艾含有挥发油、鞣质、萜类和多酚类物质等化学成分[4-6]，其中，多酚类物质在生物活性方面发挥了重要作用。多酚类物质是植物中最常见的活性物质，可分为黄酮类、简单酚类、酚酸类及花色苷类等，具有很强的抗氧化、抗衰老、抗菌、抗炎、降胆固醇和预防心血管疾病等作用。多酚类物质也是植物中的主要抗氧化活性成分，以黄酮类为主[7-8]，是预防或减少慢性疾病的关键，具有广阔的应用前景[9]。

艾叶作为中医常用药，目前公认湖北省蕲春县所产的蕲艾最佳，故相关研究主要集中于蕲艾，且对于艾叶挥发油的研究较为普遍。随着艾叶市场需求增大，宛艾产业迅猛发展，南阳市已成为中国最大的艾叶输出基地。相关研究表明，宛艾的高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)指纹图谱可与蕲艾聚为一类，且质量高于其他品种艾叶[10-12]。但是，目前关于宛艾的基础研究还比较薄弱，有关多酚类物质的研究更是鲜有报道。因此，本研究以宛艾为原料，以总多酚和总黄酮得率为考察指标，优化宛艾多酚类物质提取工艺，采用高效液相色谱法定性定量分析组成成分，评估其抗氧化活性，以期为宛艾产业发展及其多酚类物质的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

宛艾，购自南阳市宛名艾草制品有限公司；芦丁，分析纯，购自中国食品药品检定研究院；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、亚硝酸钠、氢氧化钠、碳酸钠、没食子酸、抗坏血酸，分析纯，购自山东西亚化学股份有限公司；2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)，分析纯，购自美国Sigma公司；硝酸铝，分析纯，购自成都市科龙化工试剂厂；甲醇，分析纯，购自重庆川东化工有限公司；新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C标准品(纯度≥98%)，购自成都曼斯特生物科技有限公司；乙酸，色谱级，购自西陇科技股份有限公司；乙腈，色谱级，购自美国Fisher chemical公司。

1.2 试验设备

752紫外可见光分光光度计(上海舜宇恒平科技仪器有限公司)；KQ3200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；YF-118B高速药物粉碎机(浙江省瑞安市环球药械厂)；AUW220D分析天平(日本岛津公司)；3-18KS型冷冻离心机(美国Sigma公司)；Shimadzu 20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 宛艾叶多酚类物质提取 称取宛艾样品粉末0.1 g(过60目筛)，加入体积分数80%甲醇，超声波提取60 min，25 ℃冷却，13 000 r·min-1离心10 min，取上清液，即得提取物溶液，于-18 ℃冷冻保存。

1.3.2 总多酚得率测定 参照文献[13]的方法进行，采用福林-酚法测定多酚含量，以没食子酸为标准品，760 nm处测定吸光度值，没食子酸质量浓度为横坐标(x)，吸光度为纵坐标(y)，绘制标准曲线，得回归方程为：y=0.004x+0.019(R2=0.997 0)。根据公式(1)计算总多酚得率。

(1)

式中：N为稀释倍数；C为经吸光度计算得出的总多酚质量浓度；V为提取物体积；m为宛艾质量。

1.3.3 总黄酮得率测定 参照文献[14]的方法进行，采用硝酸铝比色法测定总黄酮含量，以芦丁为标准品，510 nm处测定吸光度值，以芦丁质量浓度为横坐标(x)，吸光度值为纵坐标(y)，绘制标准曲线，得回归方程为：y=0.005x+0.012(R2=0.999 0)。根据公式(2)计算总黄酮得率。

(2)

式中：N为稀释倍数；C为经吸光度计算得到总黄酮质量浓度；V为提取物体积，；m为宛艾质量。

1.3.4 宛艾多酚类物质提取单因素试验 精密称取宛艾样品粉末0.1 g，设定m(宛艾/g)∶V(甲醇/mL)(以下简称“宛艾质量体积比”)=1∶40，甲醇体积分数80%，超声时间60 min，超声次数1次为固定条件，分别考察宛艾质量体积比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70)、甲醇体积分数(50%、60%、70%、80%、90%、100%)、超声时间(15、30、45、60、75、90 min)和提取次数(1、2、3、4次)对总多酚和总黄酮得率的影响。

1.3.5 宛艾多酚类物质提取响应面优化试验 根据单因素试验结果，通过Box-Behnken中心组合法进行响应面设计，优化宛艾多酚类物质提取工艺。以宛艾质量体积比(A)、甲醇体积分数(B)、超声时间(C)为自变量，总多酚和总黄酮得率为响应值(Y1、Y2)进行回归拟合分析。

1.3.6 宛艾多酚类物质的组分分析 参照DUAN等[15]的方法并做适当修改，将宛艾提取物和多酚标准品过0.22 μm有机滤膜，用于HPLC法分析。色谱条件：采用Acclaim 120 C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)-体积分数0.1%乙酸(B)；流速0.7 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量10 μL；检测波长340 nm。梯度洗脱程序：0～5 min，体积分数88% B；5～15 min，体积分数88%～78% B；15～25 min，体积分数78% B；25～35 min，体积分数78%～75% B；35～40 min，体积分数75%～60% B。

1.3.7 宛艾多酚提取物抗氧化能力的测定 (1) DPPH自由基清除能力测定：参考周春峰等[16]的方法测定，以抗坏血酸为对照，宛艾提取物稀释后于517 nm波长处测定样品的吸光度Ai；以乙醇溶液为空白，测定其吸光度Aj。根据公式(3)计算样品DPPH自由基的清除率。

(3)

(2) ABTS+·自由基清除能力测定：参考SOONG等[17]的方法测定，以抗坏血酸为对照，宛艾提取物稀释后于734 nm波长处测定样品的吸光度Ai；以去离子水为空白，测定其吸光度Aj。根据公式(4)计算样品ABTS+·自由基的清除率。

(4)

1.3.8 数据分析 采用Design Expert.8.0.6软件处理设计响应面试验和处理数据，采用Origin 8.0计算清除自由基的半数抑制率(IC50值)和Excel 2007软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 宛艾多酚类物质提取单因素试验结果

2.1.1 宛艾质量体积比对多酚类物质得率的影响 宛艾质量体积比对总多酚和总黄酮得率的影响如图1所示。当宛艾质量体积比小于1∶60时，总多酚得率随着宛艾质量体积比增加而增加；当质量体积比为1∶60时，总多酚得率最大为5.28%；当宛艾质量体积比大于1∶60时，总多酚得率呈下降趋势。宛艾总黄酮得率随宛艾质量体积比增加而增加；当宛艾质量体积比大于1∶50时，总黄酮得率大幅度增加，当宛艾质量体积比为1∶60时为10.99%；随着宛艾质量体积比继续增加，总黄酮得率增加缓慢。

图1 宛艾质量体积比对总多酚和总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of mass volume ratio of Wan’ai on the yield of total polyphenols and total flavonoids

2.1.2 甲醇体积分数对宛艾多酚类物质得率的影响 甲醇体积分数对宛艾总多酚和总黄酮得率的影响如图2所示。随着甲醇体积分数增加，总多酚和总黄酮得率呈现先增加后降低的趋势。当甲醇体积分数为70%时，总多酚和总黄酮得率均最大，分别为4.95%、11.67%，继续增加甲醇体积分数，总多酚和总黄酮得率下降。

2.1.3 超声时间对宛艾多酚类物质得率的影响 超声时间对宛艾总多酚和总黄酮得率的影响如图3所示。总多酚和总黄酮得率随超声时间的增加均呈现先增加后减小再缓慢增加的趋势，但缓慢增加幅度不大。当超声时间为45 min时，总多酚和总黄酮得率均最高，分别为4.80%、10.01%。

图2 甲醇体积分数对宛艾提取物总多酚和总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of methanol volume fraction on the yield of total polyphenols and total flavonoids from Wan’ai

图3 超声时间对宛艾提取物总多酚和总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on the yield of total polyphenols and total flavonoids from Wan’ai

2.1.4 提取次数对宛艾多酚类物质得率的影响 提取次数对宛艾总多酚和总黄酮得率的影响如图4所示。随着提取次数增加，总多酚和总黄酮得率增加，提取3次时分别为5.03%、10.65%，之后增加幅度较小。考虑到经济和时间成本，选取提取次数为3次。

2.2 宛艾多酚类物质提取响应面工艺优化结果

2.2.1 宛艾多酚类物质提取响应面优化设计与试验结果 为确定宛艾多酚类物质的最佳提取工艺，以单因素试验结果为依据，采用Box-behnken的中心组合设计原理，以总多酚和总黄酮得率为考察指标，对宛艾质量体积比(A)、甲醇体积分数(B)、超声时间(C)3个水平进行编码，响应面分析试验的因素和水平见表1，设计方案及结果见表2。

2.2.2 回归方程的建立与显著性检验 对表2中的试验数据进行多元回归拟合，得到宛艾总多酚对试验因素的二次多项方程为Y1=6.23+0.20A+0.11B+0.24C-0.068AB-0.068AC-0.034BC-0.091A2-0.11B2-0.71C2，宛艾总黄酮对试验因素的二次多项方程为Y2=13.20+0.15A+0.048B+0.24C-0.060AB-0.37AC-0.054BC-0.22A2-0.27B2-1.01C2，决定系数分别为0.990 2、0.974 8，校正系数分别为0.977 6、0.942 4，表明该模型能解释总多酚响应值变化的97.76%，解释总黄酮响应值变化的94.24%，变异系数分别为1.16%、1.23%，该回归模型重现性较好，拟合程度较好。

图4 提取次数对宛艾提取物总多酚和总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of extraction times on the yield of total polyphenols and total flavonoids from Wan’ai

表1 响应面试验因素水平及编码Table 1 Factors and levels in response surface

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

试验方差分析结果见表3和表4。模型P值均小于0.000 1，表明回归模型达到显著水平，失拟项均不显著(P>0.05)，表明拟合程度较好，模型建立有效[18]。影响宛艾提取物总多酚得率的因素主次顺序为超声时间>宛艾质量体积比>甲醇体积分数。一次项检验中自变量A、B、C对该模型影响极显著；二次项检验中A2、B2、C2影响显著；交互项均不显著，表明各因素对总多酚得率有影响，而因素间的交互作用影响不显著。影响宛艾提取物总黄酮得率的主次顺序为超声时间>宛艾质量体积比>甲醇体积分数。一次项检验中自变量A、C对该模型影响显著，自变量B无显著影响；二次项检验中A2、B2、C2均影响显著；交互项AC影响显著，而其他交互项未达到显著效果，表明各因素对总黄酮得率的影响不是简单的线性关系，而是非线性关系。

表3 总多酚回归模型方差分析结果Table 3 Analysis of variance of total polyphenols for the fitted regression model

表4 总黄酮回归模型方差分析结果Table 4 Analysis of variance of total flavonoids for the fitted regression model

2.2.3 宛艾多酚类物质提取响应面分析与验证试验 宛艾多酚类物质提取工艺中宛艾质量体积比、甲醇体积分数、超声时间3个因素之间交互作用对总多酚和总黄酮得率的影响如图5所示。响应曲面坡度越陡峭，总多酚和总黄酮得率对于操作条件的改变越敏感，反之曲面坡度越平缓，操作条件的改变对总多酚和总黄酮得率的影响也就越小。超声时间的曲线比较陡峭，表明超声时间对总多酚和总黄酮得率的影响最为显著，其次为宛艾质量体积比和甲醇体积分数，表现为曲线较平缓。

经Design Expert 8.0.6统计软件优化，总多酚最佳提取条件为宛艾质量体积比m(宛艾/g)∶V(甲醇/mL)=1∶68.44、甲醇体积分数72.86%、超声时间46.36 min，理论得率为6.35%；总黄酮最佳提取条件为宛艾质量体积比m(宛艾/g)∶V(甲醇/mL)=1∶62.76、甲醇体积分数70.51%、超声时间46.01 min，理论得率为13.23%。为方便实际操作，综合考虑影响总多酚和总黄酮得率各因素以及经济成本，将提取工艺调整为宛艾质量体积比m(宛艾/g)∶V(甲醇/mL)=1∶63、甲醇体积分数71%、超声时间46 min，重复3次试验进行验证，最终得到总多酚和总黄酮得率分别为6.27%、13.21%，与模型理论值相近，表明该模型能较好用于优化宛艾多酚类物质提取工艺。

图5 宛艾多酚类物质提取各因素交互作用影响的响应面图

2.3 宛艾多酚类物质组分分析

为进一步明确宛艾多酚类物质的组成，采用HPLC法对宛艾样品进行定性定量分析，混合标准品和宛艾样品色谱图如图6所示，各种标准品的保留时间具有明显差异。宛艾样品中含有新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C 共5种成分。以标准品峰面积对含量进行线性回归，回归方程见表5。宛艾多酚类物质含量排序为异绿原酸A>异绿原酸C>绿原酸>隐绿原酸>新绿原酸，以异绿原酸A为主要酚酸，含量为53.45 mg·g-1。

注：1,新绿原酸；2,绿原酸;3,隐绿原酸;4,异绿原酸A;5,异绿原酸C。

表5 宛艾样品中多酚类物质组分含量Table 5 The contents of polyphenols from Wan’ai

2.4 宛艾多酚提取物抗氧化能力分析

2.4.1 DPPH阳离子自由基清除能力 宛艾多酚提取物和抗坏血酸对清除DPPH自由基能力如图7所示。在0～40 mg·L-1，宛艾多酚提取物DPPH自由基清除能力随多酚质量浓度增加而增加，最高为86.48%，超过40 mg·L-1时，增加速度趋于缓慢。由表6可知，宛艾多酚提取物DPPH自由基清除率的IC50值为18.38 mg·L-1，略低于抗坏血酸18.50 mg·L-1，说明宛艾多酚提取物清除DPPH自由基能力略强于抗坏血酸。

图7 宛艾提取物DPPH自由基清除能力

表6 宛艾提取物清除DPPH自由基的IC50值Table 6 IC50 values for DPPH radical scavenging capacity of extract from Wan’ai mg·L-1

2.4.2 ABTS+·自由基清除能力 宛艾多酚提取物和抗坏血酸对清除ABTS+·自由基能力如图8所示。在试验质量浓度范围内，随着多酚质量浓度增加，宛艾多酚提取物ABTS+·自由基清除能力增加，且清除能力强于抗坏血酸。由表7可知，宛艾多酚提取物ABTS+·自由基清除率的IC50值为0.37 mg·L-1，低于抗坏血酸IC50值0.78 mg·L-1，说明宛艾多酚提取物具有较好的ABTS+·自由基清除活性。

图8 宛艾提取物ABTS+·自由基清除能力

表7 宛艾提取物清除ABTS+·自由基的IC50值Table 7 IC50 values for ABTS+· radical scavenging capacity of extract from Wan’ai mg·L-1

3 结论与讨论

宛艾是中国传统中草药，在养生保健、医疗救治以及美容等领域逐渐受到大众青睐，本研究对推进南阳市宛艾产业健康发展有重大意义。本试验采用超声辅助法提取宛艾多酚类物质，以总多酚和总黄酮得率为考察指标，采用响应面法优化提取工艺，通过HPLC法对宛艾多酚类物质进行定性定量分析，并测定其对DPPH和ABTS+·自由基的清除能力。在单因素试验中，当宛艾质量体积比大于1∶60时总黄酮得率增加缓慢，推测是因为随着宛艾质量体积比继续增加，宛艾提取物中黄酮成分逐渐达到溶解饱和状态[19]；同时，总多酚得率呈现降低趋势，推测是因为其他脂溶性成分浸出增多，阻碍了多酚溶出[20]。当甲醇体积分数高于70%时，总多酚和总黄酮得率下降，推测是甲醇体积分数较高导致脂溶性杂质溶出增多，形成竞争性抑制[21]。当超声时间超过45 min，总多酚和总黄酮得率呈下降趋势，推测是长时间超声波处理引起多酚类物质被降解或破坏[22]。经优化后的最佳提取工艺条件为宛艾质量体积比m(宛艾/g)∶V(甲醇/mL)=1∶63，甲醇体积分数71%，超声时间46 min，该条件下总多酚得率为6.27%，总黄酮得率为13.21%。黄艳玲等[23]采用响应面法优化微波辅助提取艾叶中的总黄酮提取率为8.805%，低于本研究结果。胡吉清等[24]采用水浴回流法提取不同采收期蕲艾的总黄酮得率为1.5%～6.95%，低于宛艾总黄酮得率，推测这与艾叶品种、提取方法以及测定方法不同有关。

HPLC法检出宛艾多酚类物质包括新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A和异绿原酸C，其中异绿原酸A为主要物质，含量为53.45 mg·g-1。宛艾与蕲艾和祁艾中检测出多酚类物质相同，但含量差异较大。蕲艾中绿原酸含量较高，其次是异绿原酸C和异绿原酸A[15]；祁艾中绿原酸和异绿原酸C较高，其次为异绿原酸A，而新绿原酸和隐绿原酸含量较低[25]。本研究结果表明，宛艾中含有较高的绿原酸类酚类物质，推测是合成异绿原酸A的重要原料。绿原酸类多酚物质是由咖啡酸与奎尼酸生成的缩酚酸，具有抗氧化、抗菌、免疫调节、抗动脉粥样硬化、抗炎、降糖和抑制亚硝化反应等多种生物活性[26-27]，在医药、食品和化妆品等领域有较大应用前景。体外抗氧化活性结果表明，宛艾多酚类物质清除DPPH和ABTS+·自由基的IC50值分别为18.43、0.37 mg·L-1，较抗坏血酸抗氧化活性好，表明宛艾具有较好的抗氧化活性，有望成为新的天然抗氧化剂来源。本研究通过优化宛艾多酚类物质提取工艺，最大限度挖掘其应用价值，为提升宛艾经济效益和促进产业发展提供了新思路。