血脑屏障氧糖剥夺再灌体外模型小鼠脑内皮细胞bEnd.3中微小RNA-290b-3p的作用及机制研究

张奕雯，凡子莲，李经伦，熊兰，赵自胜，李超

作者单位：1广元市第一人民医院，a神经内科，b放射科，四川 广元628000；

2西南医科大学附属医院神经内科，四川 泸州646000

中风是最具破坏性的疾病之一，排名为全世界死亡的第二大原因。中风可分为缺血性中风和出血性中风。世界卫生组织（WHO）将中风定义为由脑血管病变导致的快速发展的脑功能局灶性或全局性紊乱的临床症状，症状持续至少24 h，严重将导致死亡。缺血性中风的核心事件是大脑组织的血液供应中断，进一步导致缺氧和营养物质缺乏并加剧脑损伤。多年来，缺血性中风过程中的病理机制如细胞凋亡、炎症、氧化应激和脑水肿等得到深入研究。然而，目前对于缺血性中风的治疗仍具有很大局限，缺乏具有特定功效的药物。

血脑屏障破坏在缺血性中风诱导的脑损伤中起关键作用。缺血性中风引起的内皮功能障碍，增加微血管通透性，导致血脑屏障渗漏，随后引起脑水肿和出血性转化，并促进炎症反应，从而加重脑损伤。因此，在缺血期间保持血脑屏障完整性对中风管理具有重要意义并且需要进一步研究。最近的研究表明微小RNA（miRNA）可以调节各种中风危险因素和疾病前期机制，促进或抑制miRNA 的表达可能有益于中风后恢复。有关miRNA 在中风后血脑屏障破坏的作用及机制尚不清楚。

本研究自2019 年3 月采用体外培养的小鼠脑微血管内皮细胞株bEnd.3 细胞，氧糖剥夺再灌模型（oxygen and glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）模拟体内脑中风损伤，通过检测miR-290b-3p 的表达以及抑制miR-290b-3p 对体外血脑屏障模型通透性的影响，探讨miR-290b-3p 在体外氧糖剥夺模型下血脑屏障破坏的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠脑微血管内皮细胞株bEnd.3（ATCC 细胞库），DMEM/F12 培养基（Sigma），胎牛血清（FBS）（杭州四季青），紧密连接蛋白5（Claudin-5）抗体（Proteintech），miR-290b-3p 特异性引物（（Ribo-Bio），miR-290b-3p抑制剂（吉玛基因）。

1.2 方法

1.2.1

细胞培养 小鼠脑内皮细胞系bEnd.3 在37 ℃细胞恒温箱中孵育，DMEM/F12 补充有10%（V/V）的FBS，青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 U/mL）。小鼠脑微血管内皮bEnd.3 细胞在4～10 次传代后用于实验。

1.2.2

体外血脑屏障 bEnd.3 以2.5×10的密度接种到Transwell 小室内腔（0.4 μm 孔径）。使细胞生长5 d 以实现汇合。为了评估细胞旁通透性，将荧光素异硫氰酸酯（FITC）-葡聚糖（70 kDa；Sigma-Aldrich）以1 μmol/L 的浓度添加到腔室中。在OGD 后1、2、3、4、6 h，使用来自下腔（外）室的30 μL 培养基，用荧光读数器测量荧光强度，其中在每次测量前30 min 用新鲜培养基替换原培养基。样品中示踪剂的浓度由使用已知浓度的示踪剂拟合的标准曲线计算。确定示踪剂从上腔室到下腔室的扩散速率，表示为pmol·mm·min。

1.2.3

OGD/R 为了在体外模拟缺血，提前将bEnd.3细胞铺板，接种到24孔板中。先吸去正常培养基，用PBS 清洗细胞两次，加入无糖DMEM 培养基，24 孔板放入厌氧罐中。将厌氧罐放入恒温（37 ℃）细胞培养箱中，对细胞进行缺糖、缺氧损伤。1 h 后复灌，换成正常培养基，放入恒温细胞培养箱中分别培养至设定时间参数，以供血脑屏障研究观测使用。

1.2.4

实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）测定 首先，使用TRIzol 试剂提取总RNA。然后，使用用于qPCR试剂盒（R133-01，Vazyme Biotech）逆转录miRNA-290b-3p。接下来，进行实时荧光定量PCR检测成熟miR-290b-3p的表达。

1.2.5

蛋白质印迹法（Western Blot） 在冰上使用细胞裂解液裂解细胞提取总蛋白。4 ℃，12 000 g离心20 min。BCA 蛋白定量。12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，湿转法将蛋白转印至PVDF膜上。用TBST 洗涤PVDF 膜3 次，每次15 min。5%脱脂牛奶室温封闭2 h。加入一抗（claudin-5，1∶1 000），4 ℃过夜。用TBST 洗3 次，每次15 min。室温孵育二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 二抗，1∶2 000）2 h。用TBST 洗3 次，每次15 min。用化学发光显色法显影，拍照统计。

1.2.6

荧光素酶基因报告实验 根据Targetscan 软件预测miR-290b-3p 与Claudin-5 mRNA 3’-UTR 区结合序列。将含该结合位点的片段插入到荧光素酶报告基因质粒。构建两组质粒：包含该结合位点的野生型质粒（Claudin-5 3’UTR WT）以及突变该结合位点的突变质粒（Claudin-5 3’UTR Mut）。转染bEnd.3 细胞miR-290b-3p（Robbio）和两组质粒，摩尔比为50∶1。miRNA 对照用作阴性对照。转染后24 h 按照制造商的方案（Promega，E2920）进行测定荧光素酶活性测定。

1.3 统计学方法

数据采用SPSS 17.0 软件包进行分析。观测资料主要为计量数据，均通过正态性检验。以x ± s 描述，两组比较采用两独立样本t 检验或校正t 检验。多时点资料比较为重复测量方差分析+组间LSD-t 检验+组内差值t 检验。趋势分析为计量资料行两分类转化后的Cochran Armitage 趋势检验。以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外OGD/R 模型下血脑屏障通透性增加

构建体外血脑屏障模型，见图1。在OGD/R 后，血脑屏障在4 h 和6 h 遭到破坏，对FITC-葡聚糖通透性明显增加，与对照组及与1 h 比较，各时间点FITC-葡聚糖（70 kDa）血脑屏障通透量均差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表1 OGD/R后各时间点FITC-葡聚糖（70 kDa）血脑屏障通透性比较/（pmol·mm-2·min-1，x ± s）

此外，再以OGD/R 组FITC-葡聚糖（70 kDa）数据的总均值为界值，将OGD/R 组每个样本转化成两分类计数资料，行Cochran Armitage 趋势检验，结果提示其通透性有随时间增加的趋势（χ=25.046，P ＜0.05）。

图1 构建体外血脑屏障模型

2.2 OGD/R 后miR

-

290b

-

3p 表达增加

在OGD/R后，小鼠脑内皮细胞bEnd.3 中miR-290b-3p 表达呈时间依赖性升高。与对照组及与1 h 比较，各时间点miR-290b-3p 表达量均差异有统计学意义（均P ＜0.05）。见表2。

表2 OGD/R 后各时间点miR-290b-3p表达量比较/x ± s

2.3 miR-290b-3p与Claudin-5 mRNA 结合

利用miRNA 靶基因预测软件Targetscan 预测出miR-290b-3p与Claudin-5直接结合，见图2。荧光素酶实验miR-290b-3p与Clauldin-5 的结合，结果见表3。

2.4 敲低miR-290b-3p 缓解OGD/R 后血脑屏障的破坏

抑制OGD/R 后miR-290b-3p 的表达可以改善bEnd.3细胞OGD/R后Claudin-5的降低现象，并且抑制mi-290b-3p 的表达可降低体外血脑屏障模型对FITC-葡聚糖的通透性。结果图3。

表3 miR-290b-3p与claudin-5结合数据/（n=6，x ± s）

图2 miRNA靶基因预测软件Targetscan预测miR-290b-3p与Claudin-5直接结合结果

图3 敲低miR-290b-3p缓解OGD/R后血脑屏障破坏的条带图

3 讨论

血脑屏障在维持中枢神经系统稳定中发挥重要作用，其可以将神经系统与外周免疫系统分开，防止大脑受到有毒物质的影响；同时，血脑屏障可以阻碍大分子物质进入脑内。在缺血性脑损伤中，血脑屏障的通透性完整性遭到破坏，并诱导脑水肿，加重脑损伤。因此探究缺血性中风后血脑屏障的损伤机制具有重要意义。

本研究发现OGD/R 后体外血脑屏障模型的通透性增加，并伴随着miR-290b-3p 的表达增加。miRNA 是长度约22 个核苷酸的单链非编码RNA 分子，其通过与mRNA 分子的3′非翻译区（UTR）结合并使促进mRNA 降解或抑制它们的翻译而充当基因表达的调节剂。miRNA分析技术（微阵列分析）在缺血性脑损伤中的应用始于2008 年。研究发现miRNA 对脑缺血中下游靶基因具有潜在调节作用，从而在缺血性脑损伤中发挥重要作用。

Claudin-5 是血脑屏障中的紧密连接蛋白。大量研究表明，Claudin-5 可调节血脑屏障的完整性和通透性。并且Claudin-5表达的增加在神经系统疾病中起着神经保护作用，特别是在脑缺血性中风中。此外，Claudin-5 可能是缺血性中风早期出血性转化检测的潜在标志物。介于Claudin-5在维持血脑屏障完整性和通透性中的重要作用，目前开发出药物治疗，激素治疗，受体靶向，基因治疗和物理治疗等治疗方法，旨在通过Claudin-5 调节血脑屏障达到治疗缺血性中风的目的。这些证据表明，Claudin-5 在缺血性中风中对维持BBB 完整性起着重要作用。在缺血性脑中风后，Claudin-5 的表达降低，这会导致BBB 的破坏，导致脑损伤加剧。然而，目前许多问题仍未得到解决。例如，中风后Claudin-5 表达降低的机制是什么？虽然前期有研究发现基质金属酶（MMP）可介导脑缺血后大鼠血脑屏障中claudin-5的破坏，但是脑中风后Claudin-5 的破坏是否涉及其他机制仍需继续研究。鉴于miRNA 在基因表达中调控作用，本研究通过miRNA靶基因预测及荧光素酶报告实验发现miR-290b-3p直接靶向Claudin-5。本研究发现miR-290b-3p 对Claudin-5 具有调节作用，下调OGD/R 后miR-290b-3p 的水平，Claudin-5 的表达增加，并且体外血脑屏障模型对FITC-葡聚糖的通透性降低，这表明下调miR-290b-3p 可促进Claudin-5 的表达从而发挥血脑屏障保护作用。

本研究结果表明，小鼠脑内皮细胞bEnd3 中miR-290b-3p 在OGD/R 后表达增加，这会增加miR-290b-3p 与Claudin-5 mRNA 的结合，促进Claudin-5 mRNA 的降解，这可能是Claudin-5 在OGD/R 后降低的原因之一。因此抑制OGD/R 后miR-290b-3p表达上调可通过增加Claudin-5 的表达来保护BBB 完整性。综上，miR-290b-3p 可能作为预防中风后BBB破坏的治疗靶点。