补肾法通过抑制内质网应激提高子宫内膜容受性研究*

河北中医学院 河北省中西医结合肝肾病证研究重点实验室

何 莲 杜澍金 曹 璨 范丽洁 贺 明 陈景伟 张 宇(石家庄 050200)

提要 目的：研究补肾法(补肾调经方)对控制性超促排卵(COH)小鼠围着床期内质网应激的影响，探讨其提高子宫内膜容受性的作用机制。方法：实验小鼠建立COH模型并给予补肾干预，观察小鼠妊娠数和胚胎种植数，于孕4 d取子宫，Western blot和实时定量PCR分析子宫组织中雌激素受体(ERα)和内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的表达变化；组织免疫荧光观察ERα和GRP78在子宫内膜的分布。结果：模型组小鼠妊娠数、胚胎种植数显著低于正常组(P<0.05)；模型组小鼠ERα和GRP78在子宫内膜基质细胞、微血管内皮细胞中表达，且ERα的表达水平显著降低(P<0.05)，GRP78的表达水平显著增高(P<0.05)。与模型组相比，给予补肾调经方干预后，小鼠妊娠数、胚胎种植数明显增高(P<0.05)；ERα的mRNA和蛋白水平明显增高(P<0.05)，GRP78的mRNA和蛋白水平显著降低(P<0.05)。结论：补肾法(补肾调经方)改善COH小鼠子宫内膜容受性，与促进ERα表达抑制子宫内膜内质网应激有关。

体外授精(IVF)是目前治疗不孕症的主要手段，但每次胚胎移植的妊娠率仍然较低，仅占20%～30%。究其原因，1/3是卵母细胞质量及胚胎内在缺陷，2/3在于子宫内膜容受性不良。故提高子宫内膜容受性已成为胚胎成功着床的关键因素[1-2]。

研究发现，补肾法中的补肾调经方具有增加子宫内膜厚度、提高子宫内膜容受性的作用[3-4]。建立控制性超促排卵(COH)模型并给予补肾干预，观察补肾调经方对子宫雌激素受体(ERα)和葡萄糖调节蛋白78(GRP78)表达的影响，探讨补肾法改善内质网应激，提高子宫内膜容受性的可能机制。这对于揭示中医“肾主生殖”的理论内涵，探索中医调经种子的作用机制意义重大。

1 实验材料

1.1 实验动物 8～10周龄雌性昆明系小鼠60只，健康未孕，清洁级，体质量为25～30 g；雄性昆明系成年小鼠30只，体质量为30～35 g。购自河北省实验动物中心。饲养于清洁级环境中，环境温度23℃～25℃，自由进食进水。

1.2 主要药物 补肾调经方组成：山茱萸15 g，山药12 g，熟地黄20 g，枸杞子12 g，紫河车10 g，菟丝子12 g，淫羊藿10 g，女贞子9 g，覆盆子、当归各10 g，香附6 g，白芍9 g，丹参10 g等。均购自河北中医学院国医堂药房，制成1.5 g生药/mL精致混悬液。

1.3 主要试剂 尿促性腺激素(HMG)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)(丽珠医药集团股份有限公司)，促性腺激素释放激素类似物(GnRHa)(YZ-140667-20 mg, 北京索莱宝科技有限公司)。ERα抗体(sc-71064, Santa Cruz)；GAPDH抗体(10494-1-AP, Proteintech)；GRP78抗体(ab108615, Abcam)；HRP鼠二抗(sc-516102, Santa Cruz)；荧光二抗(SA0008-2, Proteintech)；Total RNA Kit Ⅱ(R6934-01, OMEGA)；M-MLV (H-) Reverse Transcriptase(R021-01, Vazyme)；SYBR qPCR Master Mix(Q311-02, Vazyme)。

2 实验方法

2.1 动物模型建立 按照参考文献[5]复制COH模型。将60只成年雌性小鼠行阴道脱落细胞学检查2个动情周期，于动情后期开始对周期规律者用药。每日9:00腹腔注射GnRHa(40 IU/100 g)，连续9 d，1次/d；第9 d同时注射HMG(400 IU/kg)，第11 d 9:00注射hCG(100 IU/100 g)，COH造模完成。

2.2 实验动物分组与用药 将60只8～10周龄雌性昆明系小鼠分为正常组、模型组、补肾组3组,每组20只。补肾组造模同时灌胃补肾调经方0.4 mL，1次/d；正常组每日腹腔注射/灌胃等量蒸馏水；第11 d(D11)(注射hCG日)16:00，将各组小鼠按雌∶雄=2∶1合笼，次日早晨发现阴栓者记为妊娠第1 d(D1)。

2.2 标本采集与处理 于妊娠第4 d(D4)取子宫，生理盐水冲洗干净，截取一部分用4%多聚甲醛固定(用于组织免疫荧光)，另一部分立即置于液氮内，然后转入-80℃冰箱保存(用于Western blot和实时荧光定量PCR)。各组剩余小鼠于妊娠第8 d(D8)计数胚胎种植数。

2.3 检测

2.3.1 组织免疫荧光染色：取小鼠子宫组织的石蜡切片，经烤片、脱蜡、水化、抗原修复后，10%山羊血清室温孵育30 min，4℃过夜封闭一抗：ERα抗体(1∶50稀释)、GRP78抗体(1∶50稀释)。第2 d，PBS洗片，荧光二抗孵育1 h，DAPI孵育10 min，封片。最后利用Leica公司SP8激光共聚焦显微镜观察并拍照。

2.3.2 实时定量PCR：取子宫组织剪碎，加入TRIZOL试剂组织匀浆管匀浆，提取总RNA。利用试剂盒将总RNA逆转录成cDNA后，按SYBR qPCR Master Mix使用说明书进行PCR。采用2-ΔΔCt法计算目的mRNA的相对表达量。所用引物序列如表1。

表1 所用引物序列

2.3.3 Western blot分析：提取子宫组织蛋白液，与5×上样缓冲液混匀，变性处理后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。转膜，并用5%牛奶37℃封闭2 h。TTBS洗膜后，一抗(Anti-ERα和Anti-GRP78均1∶500稀释)孵育，4℃过夜。第2 d洗膜后，二抗(1∶20 000稀释)室温孵育2 h，洗膜。利用化学发光成像分析系统(LAS 4000，美国GE公司)曝光显影，检测抗体特异性结合条带。

3 结果

3.1 各组小鼠妊娠率及胚胎种植数 与正常组相比，模型组妊娠率和胚胎种植数均明显降低(P<0.05)；与COH模型组相比，补肾组妊娠率和胚胎种植率均明显增高(P<0.05)，但与正常组差异无显著性(P>0.05)。详见表2。

3.2 各组小鼠围着床期子宫内膜ERα及GRP78蛋白变化 ERα在子宫内膜腔上皮、腺上皮细胞、基质细胞及微血管中均有表达。与正常组相比，模型组子宫内膜ERα的表达明显降低，而GRP78明显增高。补肾组子宫内膜ERα的表达明显增高，而GRP78明显降低，与正常组差异无显著性(P>0.05)。见图1。

表2 各组小鼠的妊娠数和胚胎种植数比较

注：M 模型组；BS 补肾组；Merge(ERα与DAPI、GRP78与DAPI的组合)。

3.3 各组小鼠围着床期子宫内膜ERα及GRP78 mRNA的表达 模型组中ERα mRNA表达明显降低(P<0.05)，GRP78 mRNA表达明显升高(P<0.05)。而补肾组中ERα表达明显高于模型组(P<0.05)，GRP78表达明显低于模型组(P<0.05)，ERα和GRP78表达与正常组差异无显著性(P>0.05)。见图2。

3.4 各组小鼠种植窗期子宫内膜ERα及GRP78蛋白的表达 检测各组小鼠子宫内膜中蛋白表达水平，模型组ERα明显降低(P<0.05)，GRP78明显增高(P<0.05)。而补肾组中ERα明显高于模型组(P<0.05)，GRP78明显低于模型组(P<0.05)，ERα和GRP78蛋白表达与正常组差异无显著性(P>0.05)。见图3。

注：与正常组(Con)相比，*P<0.05；与模型组(M)相比，#P<0.05。

注：A. Western blot条带结果。B. 相对灰度值。与正常组(Con)相比，*P<0.05；与模型组(M)相比，#P<0.05。

4 讨论

IVF-ET辅助生殖技术日益成熟，在生殖医学领域发挥着重要作用。控制性超促排卵是IVF-ET过程中的重要环节，尽管可以通过控制性超促排卵获取多个卵子，但是胚胎种植的妊娠率仍较低。胚胎的成功植入需要高质量的胚胎、容受性好的子宫以及胚胎和内膜之间一系列的紧密调节作用。其中，如何改善子宫内膜容受性一直是生殖医学研究人员关注的重点问题。

中医认为，肾藏精，主生殖。《素问·六节藏象论》曰：“肾者，主蛰，封藏之本，精之处也。”[6]胎元进入胞宫之后，肾即行使其封藏功能，肾精充盈，气血充足则子宫内膜有所养而表现出最大容受能力，与现代医学所说的胚胎着床以及子宫内膜容受性不谋而合。中医认为，肾精充足、肾气旺盛子宫内膜得以生长。反之，若肾气虚弱、肾精不足则男女之精无以植入胞宫。因此，肾虚是子宫内膜容受不良的主要病机。临床上补肾法/补肾活血法是治疗不孕症的常用方法，且疗效肯定。补肾中药可以增加子宫内膜厚度，改善子宫内膜形态，增加子宫血流，进而改善子宫内膜容受性，提高临床妊娠率[7-8]。对于肾气阴虚的患者，连方等[9]临床研究发现复方二至天癸颗粒可以减少子宫内膜局部T淋巴细胞数量，从而提高妊娠率。肾虚，运化无力可致瘀血内阻于胞宫，从而引起不孕。补肾活血法可以促进子宫内膜标志物HOXA10、HOXA11、血管内皮生长因子VEGF的表达、MVD和LIF表达，证实该法可以改善子宫内环境，从而提高妊娠率[10-12]。本研究建立COH小鼠模型，并在模型建立过程中每日对小鼠灌胃补肾调经方0.4 mL(等效于临床剂量)进行干预，证实了COH明显降低了小鼠的妊娠率和胚胎种植数，而中药补肾调经方可以显著提升COH小鼠的妊娠率和胚胎种植数，其治疗结果与正常小鼠差异无显著性。

内质网是细胞内的一个精细的膜系统，参与分泌蛋白和跨膜蛋白的合成、折叠、成熟和翻译后修饰等[13]。研究发现，内质网应激与肌体的多种疾病发生发展相关，如心血管疾病和神经系统疾病等，其机制均与内质网应激诱导细胞凋亡有关[14]。当一些应激刺激(如缺氧、氧化应激、营养缺乏、钙稳态失衡等)干扰了内质网功能时，未折叠或错误折叠蛋白在内质网积聚，发生内质网应激(ERS)[15-16]。内质网应激时，不能正确折叠的蛋白质积聚在内质网腔内，内质网应激过强或持续时间过久，可导致不可逆转的细胞凋亡[17-18]。笔者推测，由于氧化应激、缺氧、营养缺乏、钙稳态失衡等微环境异常诱发子宫内膜细胞发生内质网应激，进而导致子宫内膜凋亡，血供减少，形态上表现为子宫内膜薄、功能上表现为子宫内膜功能不完全，致使子宫内膜容受性低，胚胎着床率低。研究发现补肾调经方可以抑制内质网应激相关蛋白GRP78表达，表明补肾调经方可以改善子宫微环境异常时所导致的子宫内膜的内质网应激，减少子宫内膜凋亡、血供减少等子宫内膜功能不良情况的出现。

ERα是属于甾体激素受体家族的重要成员，广泛存在于内皮细胞、毛细血管外膜细胞和子宫内膜基质细胞等[19]，COH过程中，ERα提前下降，基质细胞和腺细胞不同步发育，基质细胞提前蜕膜化，子宫内膜容受性下降[20-21]。笔者研究发现，补肾调经方可以促进COH小鼠中ERα表达，因此推测补肾调经方可能通过提高ERα水平，进而调节GRP78的表达，以达到改善子宫内膜厚度及血供、维护子宫内膜功能完整性的目的。其具体机制及相关信号通路，还尚待进一步研究。