锦灯笼对对乙酰氨基酚所致药物性肝损伤大鼠JNK/c-jun/c-fos信号通路的影响*

河北中医学院药学院 河北省高校中药组方制剂应用技术研究中心

王瑞龙 王 茜 张睦清△ 韩 雪 郝 蕾 张一昕 (石家庄 050200)

提要 目的：通过检测大鼠血清肝功能指标和肝组织磷酸化的c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)、原癌基因(c-jun)、即早基因(c-fos)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)蛋白的表达，观察锦灯笼对对乙酰氨基酚(APAP)所致药物性肝损伤(DILI)大鼠的干预作用及机制。方法：将50只wistar大鼠称重后随机分5组，正常组、模型组、阳性药(水飞蓟宾)对照组以及锦灯笼高、低剂量组。给予各用药组相应药液灌胃给药同时，正常组与模型组则灌饲蒸馏水，共计30 d。实验结束时，用生化分析仪检测血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)活性；用Western-Blot技术检测肝组织中p-JNK的蛋白表达情况；用免疫组化法观察c-jun、c-fos、HMGB1蛋白表达。结果：锦灯笼高、低2个剂量组皆能明显地降低模型大鼠的AST、ALT活性及DBIL、TBIL 的含量(P<0.05，P<0.01)，不同程度下调c-jun、c-fos、HMGB1、p-JNK蛋白表达(P<0.05，P<0.01)。结论：锦灯笼各剂量组对DILI大鼠有明显的保护作用，其作用机制可能与抑制c-fos、c-jun 、HMGB1及p-JNK蛋白的表达有关，对APAP所致肝损伤起到保护作用。

对乙酰氨基酚(APAP)是临床常用的解热镇痛药，但因治疗感冒的多种复方制剂中均含有APAP，导致公众在自行购买感冒药治疗疾病时造成无意识的APAP使用过量，从而造成不同程度的肝损伤。目前临床治疗APAP过量，主要是在中毒早期使用N-乙酰半胱氨酸，但如果不能及时发现药物中毒则解毒剂的效果就会降低[1]。因此，探寻能够早期诊断APAP肝毒性的生物标志物，基于中医药理论研发具有护肝作用的中药新药，对于临床防治药物性肝损伤(DILI)意义重大。

锦灯笼为茄科的多年生草本植物酸浆，用药部位为其干燥的宿萼以及带有果实宿萼，味苦，性寒，归肺经，功效清热解毒、利咽化痰、利尿通淋。传统常用于治疗咽痛音哑，痰热咳嗽，小便不利，热淋涩痛等病证[2]。现代研究发现，锦灯笼不仅具有抗炎、利尿、抗氧化、护肝等药理作用，且临床医家常重用锦灯笼治疗肝炎[3-7]。基于中医认为DILI由湿热毒瘀所致的病机特点，笔者认为锦灯笼可通过清热解毒、利水除湿的功效，祛除DILI湿热毒瘀之邪，从而达到护肝的目的。为了进一步探讨其防治DILI作用机制，为研发护肝新药提供依据，本文拟通过检测肝功能指标以及在诊断APAP过量引起的肝损伤方面更灵敏的高迁移率族蛋白1(HMGB1)蛋白表达情况，揭示其护肝疗效，通过检测在APAP诱导的肝损伤中发挥重要作用的c-Jun氨基末端激酶(JNK)、原癌基因(c-jun)和即早基因(c-fos)蛋白表达的情况，探讨锦灯笼基于JNK/c-jun/c-fos通路的保肝作用机制[8-13]。

1 材料

1.1 药物 锦灯笼采用现代中药制剂，四川新绿色药业公司加工生产的固体配方颗粒。水飞蓟宾胶囊(每片含35 mg，批号为750709172)，产自天津的天士力胜特药业公司。APAP片(每片含0.5 g，批号016171002)由石药集团欧意药业有限公司提供。

1.2 动物 清洁级别的wistar品系大鼠58只，体质量(175～215)g，雌雄各半，北京维通利华生物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0006。

1.3 试剂 谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)试剂盒(批号分别为AUZ3651、AUZ3687)，贝克曼库尔特实验系统有限公司；总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)试剂盒(批号分别为A005、A006)，长春汇力生物技术有限公司；P-JNK兔单抗(Tyr185)，Cell Signaling Technology公司；β-actin小鼠单抗(批号17AV0431)、辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)批号136079)、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(批号135472)、c-Fos的兔多抗(批号00058736)、c-jun兔多抗(批号GR156116-1)和高迁移率族蛋白B1的一抗皆购自于武汉三鹰生物技术有限公司；二抗(goat，批号K186871A)，DAB(批号K187815P)，北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.4 仪器 半自动生化仪(Humalyzer2000，德国豪迈)；显微图像分析系统(HMIAS-2000，武汉同济医科大学)；电泳仪(北京百晶生物技术有限公司)；Tanon Gis电泳图像分析系统(Tanon1600)；Quantity one分析软件(Bio-Rad Technical Service Department)等。

2 方法

2.1 分组与给药 实验时将大鼠按体质量随机分为正常组、模型组、阳性药(水飞蓟宾)对照组、锦灯笼高、低剂量组(用量分别为6.67 g生药/kg，1.673 g生药/kg)5组，其中正常组10只，其余每组各12只，雌雄各半。参考文献进行造模给药[14]。给予各用药组相应药液灌胃同时，正常组与模型组则灌饲蒸馏水，连续给药30 d。

2.2 标本制备 实验结束时，3.5%水合氯醛(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，股动脉取血，4 000 r/min，离心10 min，分离血清。取血后迅速剖开腹腔将取最大叶固定部位肝组织分成2份，分别用4%多聚甲醛液固定及冻存管液氮冻存。

2.3 血清样本检测 按照试剂盒说明书用比色法和检测血清AST、ALT活性，用胆红素氧化酶法测定TBIL、DBIL含量。

2.4 肝组织病理形态观察 取4%多聚甲醛溶液固定的肝脏组织，进行常规脱水、包埋、切片、HE染色，观察肝组织病理形态学变化。

2.5 肝组织p-JNK蛋白表达检测 采用Western blot法，用蛋白裂解液裂解肝组织，离心，100℃中煮沸5 min。变性，凝胶电泳，转膜，封闭1 h，一抗稀释1 000倍，4℃反应过夜，洗涤3次，二抗稀释3 000 倍，孵育60 min，洗涤，显色，曝光，洗片，分析。

2.6 肝组织c-jun、c-fos、HMGB1蛋白的免疫组化检测 常规脱水、石蜡包埋、切片后，通过脱蜡、复水、甲醇双氧水孵育、滴加一抗、二抗、化学反应显色、苏木素复染、脱水、二甲苯透明、封片等步骤观察c-jun、c-fos、HMGB1蛋白表达，用阳性反应物相对含量的积分光密度值(IOD)和平均光密度值(MOD)表示蛋白表达强弱。

2.7 数据统计 全部数据均运用SPSS21.0分析统计软件处理，根据数据类型本实验数据主要是计量资料，其差异的比较运用方差分析法，多个组间的差异比较则运用Dunnett；以P<0.05为统计分析差异具有显著性。

3 结果

3.1 锦灯笼对APAP肝损伤大鼠肝功能指标的影响 与正常组比较，模型组大鼠ALT活性、AST活性及 DBIL、TBIL 的含量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，水飞蓟宾和锦灯笼各剂量组ALT、AST活性及 DBIL、TBIL 的含量显著降低(P<0.05，P<0.01)。详见表1。

表1 各组大鼠肝功能指标的比较

3.2 锦灯笼对APAP肝损伤大鼠肝脏HMGB1蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组大鼠的肝组织HMGB1蛋白表达显著升高(P<0.01)；锦灯笼高、低剂量组均能显著下调肝损伤大鼠的HMGB1蛋白表达(P<0.01，P<0.05)；与水飞蓟宾组比较，锦灯笼高、低剂量组能显著上调HMGB1蛋白表达(P<0.01)。详见表2、图1。

表2 各组大鼠肝组织HMGB1蛋白表达的比较

注：A 正常组；B 模型组；C 水飞蓟宾组；D 高剂量组；E 低剂量组。

3.3 锦灯笼对APAP肝损伤大鼠p-JNK蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组p-JNK蛋白表达显著升高(P<0.01)；与模型组比较，锦灯笼各剂量组p-JNK蛋白表达显著降低(P<0.01，P<0.05)。详见表3、图2。

表3 各组大鼠肝组织p-JNK蛋白表达情况

注：A 正常组；B 模型组；C 水飞蓟宾组；D 高剂量组；E 低剂量组。

3.4 锦灯笼对APAP肝损伤大鼠c-jun、c-fos蛋白的表达变化的影响 对比正常组，模型组大鼠肝组织中c-jun、c-fos 2种蛋白的表达均有明显升高(P<0.01)；对比模型组，阳性药水飞蓟宾对照组与各剂量组c-jun、c-fos蛋白表达均有明显的降低(P<0.01)；锦灯笼高、低剂量组c-jun蛋白MOD值较水飞蓟宾组显著降低(P<0.05)，低剂量组c-fos蛋白IOD值较水飞蓟宾组和高剂量组显著升高(P<0.01)。详见表4、图3、图4。

表4 各组大鼠肝组织c-jun、c-fos蛋白表达的比较

注：A 正常组；B 模型组；C 水飞蓟宾组；D 高剂量组；E 低剂量组。

注：A 正常组；B 模型组；C 水飞蓟宾组；D 高剂量组；E 低剂量组。

4 讨论

随着人们生活方式的改变，现代疾病谱也发生了很大的变化，患者常身患多种疾病，经常需要多种药物联合使用，这就导致药物性肝损伤的发生越来越多。但目前对于DILI的诊断多根据服药史与肝损伤的因果关系进行定性，通过检测血清AST、ALT、ALP(碱性磷酸酶)、胆红素水平判断肝损伤程度，但有些患者出现肝损伤时以上指标并未出现明显的改变，从而延误治疗时机[15]。因此，寻找具有特异性、敏感性较高的诊断DILI 的生物标志物，是目前科研工作者普遍关注的重点问题。

研究表明，HMGB-1作为一种在真核生物细胞核内普遍存在高度保守的蛋白质，是APAP肝损伤血清诊断和严重程度评估的敏感生物标志物[16]。有学者对服用APAP过量的患者血浆进行检测，发现无论患者血浆ALT活性是否升高，HMGB-1水平均能有效识别肝损伤[17]。美国联盟临床研究结果也表明，乙酰化HMGB1水平可准确判断DILI恢复良好、发展为慢性和预后不良3种情况[18]。实验结果显示，模型组ALT、AST活性及 DBIL、TBIL 的含量显著升高，提示肝损伤模型建立成功；水飞蓟宾组和锦灯笼高、低剂量组均能显著降低ALT、AST含活性及 DBIL、TBIL 的含量。高、低剂量组均能显著下调HMGB1的蛋白表达，提示锦灯笼对药物性肝损伤有一定的防治作用。

目前APAP导致肝损伤的机制已经比较明确，主要是因为其服用过量之后在体内产生的毒性代谢产物N-乙酰对苯醌亚胺耗竭还原性谷胱甘肽，从而生成大量的活性氧，加重线粒体损伤，诱发炎症反应，引起氧化应激，激活JNK，导致肝细胞损伤[19-21]。另有研究表明，JNK介导的信号通路的活化及沉默对于肝细胞的存活—死亡—分化—增殖以及肿瘤的罹患、病情发展都有较为密切的关系，当APAP接触肝细胞后激活JNK，可引起线粒体外膜通透性变化导致细胞凋亡[22-23]；另一方面，激活过氧化物酶体增殖物激活受体 α( PPARα) 可以抑制 JNK的磷酸化，进而控制其下游的相关转录因子，如 c-Jun 和c-fos等的表达，促使线粒体中活性氧的含量下降，谷胱甘肽的含量增加，修复线粒体损伤，增强抗氧化应激能力，最终达到减轻APAP所致肝损伤的目的[24]。实验结果显示，锦灯笼高、低剂量组均能显著下调c-jun、c-fos、HMGB1及p-JNK蛋白表达，提示锦灯笼通过抑制c-fos、c-jun、HMGB1及p-JNK的表达发挥对APAP所致肝损伤起到早期干预保护作用的目的。