Gas6对类风湿关节炎小鼠Th17/Treg细胞平衡和炎症反应的调控作用

卢阳 陈萍 林素仙 姜建昌 王胜男 张智勇 杨美绿

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以关节组织慢性炎症性病变为主要表现的免疫性疾病。机体免疫系统改变，特别是细胞免疫异常，在RA发生过程中所起的关键性作用越来越受到重视[1-2]。有研究发现，在RA患者外周调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）的比例明显下降，且存在以分泌IL-17为特征的CD4+T细胞（Th17）细胞增殖，这种Th17/Treg失衡是导致RA炎症和损伤的重要因素[3-4]。既往研究发现，生长停滞特异性蛋白 6（growth arrest-specific 6，Gas6）能促进Treg功能活化（呈浓度依赖性），增强Treg对T细胞增殖的抑制能力[5-6]。此外，缺失Gas6的小鼠Th17细胞显著增殖，呈现出Th17/Treg失衡的现象，导致炎症反应的发生[7]。鉴于Treg在RA发病过程中的关键作用，笔者推测Gas6能够调控RA小鼠Th17/Treg平衡，从而减轻炎症和关节损伤，为此，笔者通过建立胶原诱导的关节炎（collagen induced arthritis，CIA）小鼠模型，探讨 Gas6对Th17/Treg细胞平衡和炎症反应的调控作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物及试剂 雄性SPF级DBA/1J小鼠24只（8周龄，体重22～25 g）购自上海斯莱克实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2012-0002，饲养于温州医科大学实验动物中心。弗氏完全佐剂（F5881）和弗氏不完全佐剂（F5506）购自美国Sigma公司，牛Ⅱ型胶原蛋白购自美国Chondrex公司（20022）。重组小鼠Gas6购自美国R & D公司（CF 8310-GS-050）。IL-10 ELISA试剂盒购自上海钦诚生物科技公司（QC-IL10-Mu），IL-17 ELISA试剂盒购自联迈生物公（LM-IL-17-Mu）。FITC标记的大鼠抗小鼠CD4抗体（553046）、PE标记大鼠抗小鼠叉头蛋白翼状螺旋转录因子 P3（Forkhead/winged helix transcription factor p3，Foxp3）抗体（560414）和PE标记大鼠抗小鼠IL-17A抗体均购自美国BD公司（561020）。

1.2 实验分组及CIA小鼠模型制备 将小鼠按照随机数字表法分为4组，即对照组、CIA组、CIA+生理盐水组和CIA+Gas6组，每组6只。参考文献[8]建立动物模型。实验遵循国际通行的动物福利和伦理准则。第1天后3组小鼠在尾根部皮下注射0.1 ml由弗氏完全佐剂与牛Ⅱ型胶原蛋白等体积（各0.05 ml）混合乳剂，第21天再次注射0.1 ml弗氏不完全佐剂与牛Ⅱ型胶原蛋白等体积（各0.05 ml）混合乳剂，构建CIA模型。对照组以0.9%氯化钠注射液替代牛Ⅱ型胶原蛋白。CIA+Gas6组小鼠在第2次注射后立即腹腔注射30 μg/ml的Gas6 0.1 ml，以后每3天1次，共3次，总剂量为9 μg。CIA+生理盐水组小鼠在第2次注射后，立即腹腔注射0.9%氯化钠注射液0.1 ml，以后每3天1次，共3次。

1.3 关节炎指数（arthritis index，AI）评分 第1次注射后42 d，对小鼠四肢进行AI评分，共分为5级。0分：正常，关节无红肿；1分：足趾关节轻度红肿；2分；足趾关节和足跖肿胀；3分：踝关节以下足爪红肿；4分：包括踝关节在内的全部足爪均有红肿且伴有功能障碍。每只小鼠AI评分为四肢关节评分之和，总分最高为16分。

1.4 IL-10和IL-17水平检测 第1次注射后42 d，小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠0.2 ml麻醉后打开腹腔，采集下腔静脉血1.0 ml，EDTA抗凝，2500 r/min，离心15min（4℃），取上清液，采用ELSIA试剂盒检测IL-17和IL-10水平。

1.5 Treg和Th17细胞检测 采用流式细胞术。下腔静脉取血完毕后处死小鼠，留取脾脏，置于40 μm孔径滤网上研磨成匀浆，用PBS重悬细胞，并调节细胞密度至1×107个/ml。等分细胞悬液，每管 50 μl，再加 50 μl流式染色缓冲液。加入抗CD4-FITC，4℃避光孵育1 h，PBS洗2次后，分别染色IL-17A和Foxp3，以检测Th17和Treg细胞比例。Th17细胞检测：每个样本加入2 ml流式染色缓冲液，400 g/min离心5 min，弃上清液，每管加入流式染色缓冲液100 μl重悬细胞，并加入1 μg/ml的IL-17A抗体，室温避光孵育1 h。Treg细胞检测：以1 ml Foxp3 Fix/permeabilization工作液重悬细胞，轻柔震荡，4℃避光孵育1 h后，每管加2 ml通透缓冲液，300 g/min室温离心 5 min，弃上清液。加100 μl通透缓冲液重悬细胞后，加入抗Foxp3抗体，4℃避光孵育1 h。上机检测前，每个样品加2 ml流式染色缓冲液，400 g/min离心5 min，弃上清液。上述过程重复2次，每管加入流式染色缓冲液1 ml上机。

1.6 踝关节病理检查 处死小鼠后，于双侧后肢膝关节处截断，去外皮和肌肉，10%中性甲醛固定48 h，采用硝酸脱钙2 h，二甲苯浸润后，石蜡包埋，制成切片，常规HE染色后光学显微镜下观察并拍照。

2 结果

2.1 4组小鼠AI评分的比较 CIA小鼠显示出明显的关节肿胀，Gas6干预后，小鼠的关节肿胀明显减轻，见图1。在造模后第42天，CIA+生理盐水组与CIA组相比AI评分差异无统计学意义（P＞0.05），CIA+Gas6组与CIA+生理盐水组相比AI评分明显下降（P＜0.01），见表1。

2.2 4组小鼠踝关节病理变化的比较 病理结果发现，对照组小鼠踝关节结构正常，未见显著的炎症细胞浸润和软骨破坏现象。CIA组小鼠踝关节可见大量炎症细胞浸润和严重的关节软骨破坏。与CIA组小鼠相比，CIA+Gas6组小鼠踝关节炎症细胞减少，关节软骨破坏减轻，见图 2（插页）。

图2 4组小鼠踝关节病理损伤的比较（a：对照组；b：CIA 组；c：CIA+ 生理盐水组；d：CIA+Gas6组；HE 染色，×100）

2.3 4组小鼠IL-10、IL-17水平的比较 与对照组相比，CIA小鼠IL-10水平升高（P＜0.05）。与CIA组比较，CIA+Gas6组IL-10水平较高（P＜0.05）。与对照组相比，CIA组小鼠IL-17水平明显升高（P＜0.01）。与CIA组相比，CIA+Gas6组 IL-17水平明显下降（P＜0.01），见表2。

2.4 4组小鼠脾脏CD4+IL-17+和CD4+Foxp3+细胞比例的比较 与对照组相比，CIA小鼠脾脏CD4+IL-17+细胞比例明显升高，而CD4+Foxp3+细胞比例显著下降（P＜0.01）。与CIA组小鼠相比，CIA+Gas6组小鼠脾脏CD4+IL-17+细胞比例明显下降（P＜0.05），CD4+Foxp3+细胞比例显著增加（P＜0.01），见图3和表3。

图1 4组小鼠关节图（a：对照组；b：CIA 组；c：CIA+生理盐水组；d：CIA+Gas6组）

表1 4组小鼠AI评分的比较（分）

表2 4组小鼠IL-10、IL-17水平的比较（pg/ml）

3 讨论

RA总体发病率约为0.3%～1.5%，且晚期致残率极高，严重威胁患者的身心健康[9]。已经证实，RA关节腔和滑膜有包括T淋巴细胞、B淋巴细胞及巨噬细胞等多种免疫细胞浸润，释放IL、TNF和IFN等炎症因子；此外，炎症因子的释放可进一步诱导免疫细胞聚集，形成恶性循环，最终引起滑膜和关节损害[1-2]。鉴于此，靶向炎症和免疫活化一直是RA治疗学研究的重点，但迄今为止临床上仍缺乏有效的干预策略和药物。

TAM受体是机体重要的“炎症开关”[5]。有研究证实，TAM受体家族缺失的小鼠，脾脏淋巴细胞大量扩增和活化，可引起机体炎症性损伤[10]。在肥胖相关的骨关节炎中发现，阻断TAM受体家族Axl后，关节损伤明显加重[11]。另据报道，Axl基因缺陷的关节炎小鼠，其滑膜炎症、骨和软骨的破坏明显增加[12]。Gas6是TAM家族的天然配体[5]。本研究发现，Gas6干预后，CIA小鼠AI评分明显下降，踝关节的病理损害也显著减轻。上述结果提示，激活Gas6-TAM通路对于减轻RA有着重要的保护作用，但其机制尚不清楚。

CD4+T淋巴细胞是机体获得性免疫应答的主要细胞。在机体内外环境的影响下，CD4+T淋巴细胞可分化为包括Treg和Th17等多种细胞亚群[3-4]。Th17细胞通过分泌IL-17，激活细胞丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）和核因子 κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）等炎症信号通路，介导促炎因子的分泌及基质金属蛋白酶的产生，参与组织炎症和组织损伤过程[8]。Treg根据其来源不同可以分为天然型和诱导型两类，Foxp3是其共同的特征和标志分子。Treg是机体免疫耐受得以维持的核心细胞，其可以通过多重机制发挥免疫抑制效应，包括表面抑制分子和分泌免疫抑制性细胞因子IL-10等[6]。Th17/Treg失衡已经被证实是RA 发生和发展的重要因素[3，8]。

图3 4组小鼠脾脏CD4+IL-17+和CD4+Foxp3+细胞流式图（A：CD4+IL-17+细胞；B:CD4+Foxp3+细胞；a：对照组；b：CIA 组；c：CIA+生理盐水组；d：CIA+Gas6组）

表3 4组小鼠脾脏CD4+IL-17+和CD4+Foxp3+细胞比例的比较（%）

与既往研究类似[3，8]，本研究发现CIA小鼠脾脏Treg比例明显降低，而CD4+IL-17+的比例明显升高，且外周血IL-17水平也显著升高。Gas6干预能够调节Th17/Treg平衡，促进Treg扩增，抑制Th17的产生，提示Gas6对RA的治疗作用可能与其对Treg/Th17平衡调控有关。本研究发现RA小鼠的外周血IL-10水平也明显增加，Gas6干预后IL-10水平进一步增加。在炎症状态下，包括Treg、Th2细胞以及单核细胞等均可代偿性分泌IL-10。IL-10一方面可抑制炎症反应，另一方面能通过刺激B细胞成熟，阻断其凋亡而发挥潜在的致炎作用。鉴于IL-10已被证实能够改善RA小鼠的关节损伤[13]，IL-10可能是介导Gas6抗炎作用的另一重要机制。

综上所述，Th17/Treg失衡参与了RA的致病过程。Gas6能够促进Treg扩增，抑制Th17细胞分化，起到减轻RA关节损害的作用。然而，Gas6调控Th17/Treg平衡的机制尚不清楚，有待进一步研究。