超声法提取梅花鹿茸总多肽及其抗炎活性

张维 于珊珊 尹宏兵

(1长春中医药大学附属第三临床医院，吉林 长春 130000；2长春中医药大学 吉林省人参科学研究院)

鹿茸是雄鹿未骨化密生绒毛的幼角，是一种特殊的软骨组织，含有多种活性因子，是鹿体在骨化之前贮存生长因子最活跃的生长点。鹿茸多肽是鹿茸主要的生物活性成分物质，对成骨细胞、造血细胞、纤维细胞、上皮细胞生长及神经生长都有明显的促进作用。本研究探讨超声破碎法提取梅花鹿茸总多肽的效果及鹿茸总多肽的抗炎活性，为今后鹿茸总多肽的研究奠定基础，同时对于后续研究梅花鹿茸总多肽对炎症细胞的毒性作用的实验研究具有借鉴意义。

1 材料与方法

1.1鹿茸总多肽的超声波提取制备方法

1.1.1超声破碎时间对鹿茸总多肽提取的影响 称取新鲜的梅花鹿茸约20 g，剁成小块后放入烧杯中，用预先放于层析柜(4℃)冷却过的蒸馏水冲洗数次，直至完全无血色；粉碎机粉碎，加入预冷的匀浆液(pH3.5的冰醋酸水溶液)50 ml加入一定量的玻璃珠，置于4℃低温摇床中6 h后，冰浴条件下超声破碎(工作5 s,停止3 s)，于超声破碎的不同时间(0,10,20,30，40,50,60,80 min时)，吸取混合溶液1 ml,于4℃，10 000 r/min离心15 min后吸取上清液，保存于4℃中，测定蛋白浓度。

1.1.2制备鹿茸总多肽 称取新鲜的梅花鹿茸200 g，按照上述的操作方法，加入预冷的匀浆液500 ml，放于4℃的恒温摇床中6 h后，冰浴条件下超声破碎，待超声结束后，于4℃，10 000 r/min离心15 min，合并上清液，冷冻干燥获得粉末。称取20 mg冻干粉，溶解于1 ml的pH3.5的冰醋酸水溶液中，脱盐后，保存于-20℃中待用。

1.2应用Tricine-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝电泳(SDS-PAGE)方法鉴定鹿茸总多肽

1.2.1溶液配制及胶制作 阴极缓冲液由三羟甲基氨基甲烷(Tris)0.1 mol/L，Tricine 0.1 mol/L和SDS 1 g/L配制而成，配制好的溶液用1 mol/g的HCl调节pH为8.25。阳极缓冲液由Tris 0.2 mol/L配制而成，配制好的溶液用1 mol/L的HCl调节pH为8.9。胶缓冲液由Tris 3.0 mol/L和SDS 3 g/L配制而成，配制好的溶液用1 mol/L的HCl调节pH为8.4待用。3C丙烯酰胺贮存液的配制：首先在100 ml纯水中溶解 1.5 g N，N′-甲叉双丙烯酰胺和48.0 g 丙烯酰胺，混匀后，用滤纸过滤待用；6C 丙烯酰胺贮存液的配制是先在100 ml纯水中溶解3.0 g N，N′-甲叉双丙烯酰胺和 46.5 g 丙烯酰胺，之后的处理同3C丙烯酰胺贮存液的配制方法。2×上样缓冲液是由120 g/L的甘油，4%的SDS，0.1 g/L的溴酚蓝组成，100 mmol/L的Tris和20 ml/L巯基乙醇，混合均匀后调节pH为6.8后待用。脱色液的配制：在900 ml 蒸馏水中加入100 ml 乙酸。染色液的配制：在450 ml 蒸馏水中依次加入2.5 g 考马斯亮蓝 R-250、100 ml 乙酸和450 ml 乙醇。凝胶是由分离胶、间隙胶和浓缩胶组成的三层不连续的结构。按表1进行Tricine-SDS-PAGE胶的配制。

表1 分离胶、间隙胶和浓缩胶的组成

1.2.2上样与电泳方法 阳极缓冲液装于外槽，阴极缓冲液装于内槽。按1∶1的比例将上样缓冲液和蛋白质样品均匀混合，水浴煮沸 5 min。在点样孔内加入10 μl样品，在另一点样孔加入蛋白质标准品10 μl。在恒压40 V条件下跑约1 h，待样品进入间隙胶后，将电压升至70 V，于恒压条件下跑至电泳结束。

1.2.3染色、脱色和胶的保存方法 电泳后的胶可于染色液中震荡染色 6～7 h，随后在脱色液中脱色数次，直至背景清晰可见，胶的保存可参考一般的SDS-PAGE保存条件。

1.2.4蛋白质含量测定 采用考马斯亮蓝染色法测定蛋白浓度，将200 μl的蛋白溶液加入试管中，再加入5 ml的考马斯亮蓝染色液，涡旋，待反应5 min后，应用紫外分光光度法于波长595 nm处测定吸光度值，根据考马斯亮蓝标准曲线计算出蛋白浓度。

1.3梅花鹿茸总多肽细胞水平抗炎活性实验

1.3.1细胞培养 RAW264.7细胞接种在含5% 胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃、5%的CO2恒温培养箱中常规培养，每天换液，2～3 d传代一次。取对数生长期细胞用于实验。

1.3.2细胞增殖活性检测 应用CCK-8比色法检测细胞增殖活性：首先将处于对数生长期的RAW264.7细胞数调至4×105个/ml，随后在96孔培养板中每孔接种100 μl RAW264.7细胞，在37℃、5%的CO2饱和湿度的培养箱中进行孵育，并于2 h后进行培养基的更换。设计模型组、给药组和空白对照组，每组3个复孔，调零选择空白孔。空白对照组中只加培养液；模型组需要将终浓度为1 μg/ml的脂多糖(LPS)加入培养液中；同时给药组设计高，中，低三个给药浓度，分别在模型组的基础上加入10 mg/ml、20 mg/ml和30 mg/ml终浓度的梅花鹿茸总多肽(分别为低、中、高剂量组)。各组细胞均培养24 h，每孔在无菌条件下加入10 μl的 CCK-8溶液，于避光条件下孵育4 h后，测定各孔在450 nm波长条件下的OD值。计算细胞相对活性。细胞相对活性=实验组OD-调零组OD/(对照组OD-调零组OD)。

1.3.3细胞上清液中IL-6和IL-1β的检测 应用ELISA检测细胞上清液中IL-6和IL-1β：首先将处于对数生长期的RAW264.7细胞数调至4×105个/ml，在24孔培养板的每孔中接种500 μl该细胞，在条件为37℃、5%的CO2饱和湿度的培养箱中孵育2 h，并随后更换培养液。分组同1.3.2，各组细胞培养均24 h，于4℃，3 000 r/min离心10 min。各组细胞上清液应用ELISA试剂盒检测其中的IL-6和IL-1β含量。按照试剂盒说明书严格操作。

2 结 果

2.1梅花鹿茸总多肽的超声波提取分离 超声0、10、20、30、40、50、60、80 min时，蛋白质浓度分别为：(0.12±0.01)mg/ml、(0.63±0.02)mg/ml、(1.12±0.01)mg/ml、(1.35±0.05)mg/ml、(1.42±0.03)mg/ml、(1.55±0.02)mg/ml、(1.58±0.02)mg/ml、(1.61±0.04)mg/ml；0～40 min，随着超声时间的延长，提取到的鹿茸多肽的浓度也在逐渐增大，超声40～80 min过程中，蛋白质的浓度变化不明显，因而可以选择超声破碎时间为40 min，从而获得较好的超声破碎提取鹿茸总多肽的效果。

2.2梅花鹿茸总多肽的 Tricine-SDS-PAGE 初步鉴定 由图1可以看出，梅花鹿茸多肽在电泳胶中呈弥散状分布，通过与标准蛋白质样品比对，可知其分子量分布在14.4～3.3 kD。

图1 梅花鹿茸总多肽的 Tricine-SDS-PAGE

2.3梅花鹿茸总多肽的抗炎活性研究

2.3.1梅花鹿茸总多肽对RAW264.7细胞的毒性实验 低、中、高剂量组对RAW264.7细胞均无毒害作用，与空白对照组相比，细胞增殖活性差异无统计学意义〔(113.579±1.24)%、(113.137±0.98)%、(115.314±1.19)%、(100.000±0.00%)；P>0.05〕，因此选择的三种梅花鹿茸总多肽可以用于后续实验研究。

2.3.2梅花鹿茸总多肽对LPS诱导RAW264.7细胞 IL-6 的表达影响 模型组IL-6与空白对照组相比明显升高(P<0.05)；与模型组相比，低、中、高剂量组IL-6含量明显降低(P<0.05)；抑制效果最佳时，其鹿茸总多肽的浓度为30 mg/ml。

2.3.3梅花鹿茸总多肽对RAW264.7细胞IL-1β蛋白的表达影响 与空白对照组相比，模型组IL-1β显著升高(P<0.01)。与模型组相比，低、中、高剂量组IL-1β含量显著下降(P<0.05)，其抑制效果最佳时的梅花鹿茸的浓度为20 mg/ml。见表2。

表2 各组细胞培养基上清中IL-6、IL-1β含量比较

3 讨 论

追溯到我国古代，人们已经开始对鹿茸的功效进行研究，起初人们只认识到鹿茸能够强身健体,对提高性功能方面有显著作用，但随着现代科学技术日新月异的发展，已经逐渐证实鹿茸含有大量的氨基酸、多肽、蛋白质、无机元素、磷脂等脂类物质和糖类化合物等复杂的化学成分，并具有抗氧化、抗炎作用、提高免疫、促进成骨细胞增殖、预防和治疗骨质疏松症、增强性功能〔1，2〕等广泛的作用。

鹿茸多肽具有抗炎作用，可降低大鼠肾上腺中胆固醇的含量和抗坏血酸含量，明显升高血清皮质醇含量，具有显著的抗炎作用，对各种急慢性炎症均具有明显疗效。同时研究还发现即使阻断垂体后，抗炎作用依然存在，证明鹿茸多肽的抗炎作用机制不完全依赖于垂体-肾上腺皮质系统〔3〕。有研究表明中成药中鹿茸口服液和鹿茸胶囊也具有相同的抗炎功效〔4～6〕在治疗和预防疾病中被广泛应用。分离鹿茸多肽的技术也在不断提高，Zha等〔7〕已成功从梅花鹿茸中分离得到一种多肽，该多肽由68个氨基酸组成且相对分子质量约为7 200 U；周秋丽等〔8〕通过应用电泳分离分析和质谱分离分析等技术手段，证明梅花鹿茸多肽的相对分子质量范围在1 000～3 000 D；随着分离技术的不断提到,目前已有技术可以从梅花鹿茸中分离得到纯度高达99%且相对分子质量约为30 000 U的一个单体多肽，张郑瑶等〔9〕利用氚-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)检测该单体多肽活性，发现其有对骨细胞有极显著的促进增殖作用，尤其是对经过原代培养的核软骨细胞和表皮细胞。梅兵等〔10〕在二杠梅花鹿茸分离得到梅花鹿多肽Ⅰ和Ⅱ，并利用生物效应实验研究，证明梅花鹿多肽组分Ⅰ和Ⅱ均具有抗炎效果及促进生长作用；Sui等〔11〕研究鹿茸多肽是否具有促进细胞增殖作用，在梅花鹿茸中分离得到一个相对分子质量为1 479.9 U的多肽，并证明该多肽对小鼠HT22细胞有促进增殖的作用；王丰等〔12〕从马鹿茸中分离得到相对分子质量为3 095.1 U的一种多肽，利用凝胶过滤层析法、离子交换层析法及高效液相等技术手段，表明鹿茸多肽对表皮细胞BRL肝细胞株的增生繁殖有明显的促进作用。鹿茸的抗炎作用的研究仍处于起步阶段，对鹿茸中具有抗炎作用的多肽成分的研究是十分有意义的。本研究结果表明LPS诱导RAW264.7细胞IL-6的高表达能够被一定浓度的梅花鹿茸总多肽所抑制。

综上所述，应用超声破碎法提取鹿茸总多肽可以获得良好的效果；鹿茸总多肽具有抗炎作用，并在不同浓度下抗炎作用效果不同。为今后进一步临床药理实验研究奠定基础。