NSCLC纵隔淋巴转移与患者胸水及血水性质的相关性

杨声灼 刘达富 邓宇江

(广西贺州人民医院 1呼吸科，广西 贺州 542800；2心胸外科)

肺癌主要包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，其中NSCLC占75%～80%〔1〕。目前，手术是治疗NSCLC主要手段，并随着胸腔镜技术设备、手术方法与微创手术指征的逐渐改变，胸腔镜微创手术已经成为NSCLC患者的常见方式〔2〕。其中胸腔镜单孔根治术发展较为迅速，手术适应指征不断扩宽至肺癌根治术与肺叶切除术等〔3〕。同时，胸腔镜单孔根治术具有手术创伤程度小、术后恢复时间短与住院时间短等优势〔4〕。胸水及血水则是评估肺癌患者预后状况常用的生物学标本，血管内皮生长因子(VEGF)具有高度特异性，可以促进血管通透性、细胞外基质变性及血管内皮细胞迁移和增殖等，同时也与血管形成有关。既往研究提示〔5～8〕VEGF水平与肺癌发生关联紧密，并且VEGF的高表达通常是肿瘤患者预后不良的重要指征。本研究拟分析胸水脱落细胞DNA含量，包含异倍体DNA含量等，以期从细胞生物学角度为患者预后转归的预测提供参考；拟对NSCLC纵隔淋巴转移与患者是否出现胸水及血水性质的相关性进行分析。

1 对象和方法

1.1研究对象 于2013年3月至2016年3月(随访时间为3年，实际研究结束日期为2019年3月)采用定群抽样的方法连续收集登记住院的NSCLC患者72例，包含59例纵隔淋巴转移患者及13例未见肿瘤转移的患者。入选标准：①患者通过病理活检确诊为NSCLC；②患者在本研究指定的医院接受全程治疗。排除标准：①患者中途转院治疗导致后期随访失败的病例；②在了解本研究目的后不愿配合调查研究的病例。

1.2研究方法 手术器械：胸腔镜(德国史托斯公司)，胸腔镜手术操作器械(中国深圳市和宏实业有限公司)，内镜直线切割缝合器(美国美敦力公司)，内镜适配钉仓(美国强生公司)，超声刀(美国强生公司)等。全部患者全身麻醉满意后进行双腔气管插管，取健侧90°卧位，采用健侧单肺通气模式，根据手术前医学影像学数据在腋前线与腋中线第4、5肋取3～5 cm长度的切口作为操作孔。在该切口插入胸腔镜探查，同时取第7、8肋间隙作为观察孔。对于手术前怀疑诊断NSCLC的患者首先进行肺叶楔形切除术，待明确冰冻病理检查报告后采用标准肺叶切除术。术中松解肺韧带，根据病灶部位采用单项式或解剖式分别处理血管、气管与肺裂，再进行纵隔淋巴结清扫术。患者在切口后缘或肌层下潜行上一肋间隙切口后缘置入24号引流管，患者术后采用静脉镇痛泵处理。DNA在波长260 nm左右可见较强的吸收峰，针对NSCLC纵隔淋巴转移患者的胸水脱落细胞进行DNA含量测定，测定中使用分光光度法完成，检测得到二倍体和异倍体的肿瘤细胞DNA指数，研究对非整倍体细胞峰值进行定量计算(-lgT=a×c，a为吸光系数，c为浓度)。研究中还对胸水脱落细胞的VEGF表达进行测定分析，使用免疫组化法完成测定，测定得到吸光度扩增曲线及相关参数，包括R值、R2值、扩增效率、标准曲线公式等，并对待测样品初始模版量进行计算评价。对受试对象进行定期随访收集生存信息，随访过程主要采用微信、电子邮件、电话联系等媒介手段记录生存情况。

1.3统计学方法 采用SPSS19.0软件采用描述性统计学指标对患者的基本情况进行统计学描述后使用不同检验方法完成组间对比；采用t检验或两独立样本秩和检验淋巴转移患者中位生存时间的影响因素；采用散点图描述胸水脱落细胞DNA含量及VEGF表达评定对NSCLC纵隔淋巴转移患者生存时间的相关性，并计算相关系数r值；采用H检验分析影响患者生存的因素，同时绘制生存曲线比较不同组别NSCLC纵隔淋巴转移患者的生存情况差异。无特殊说明情况下显著性水平α=0.05，所有P值表示双侧概率。

2 结 果

2.1患者一般资料 患者平均年龄(67.31±6.03)岁，男44例，吸烟史超过30年39例，有肺恶性肿瘤家族史12例，具备高危职业危害因素13例。从随访日开始计算起患者的生存时间最短为1个月，最长为34个月，生存中位时间为14个月；受试对象生存时间不超过6个月的23例，生存时间超过24个月的14例。

2.2胸水脱落细胞DNA含量及VEGF表达情况及其与病程的相关性 患者共出现胸腔积液32例，其中胸腔积液中含有血性成分的患者23例。胸水脱落细胞二倍体DNA含量为(245.74±34.35)U/ml，标准曲线为y=0.914x-0.415，异倍体DNA含量(75.09±13.27)U/ml，标准曲线为y=0.944x-0.284；VEGF含量为(29.20±4.90)U/ml，荧光扩增曲线的R=0.840，R2=0.704，扩增效率为85.30%。胸水脱落细胞异倍体DNA含量(r=-0.663，P<0.05)及VEGF表达丰度值(r=-0.537，P<0.05)均与患者的生存时间呈负相关。见图1和图2。

图1 胸水脱落细胞异倍体DNA含量与生存时间相关性

图2 胸水脱落细胞VEGF含量与生存时间的相关性

2.3NSCLC纵隔淋巴转移患者生存分析

2.3.1NSCLC纵隔淋巴转移患者生存时间的影响因素 对影响患者中位生存时间的因素进行分析，以109例有效观察对象测定值的均数或中位数作为高水平和低水平的划定依据，可见胸水性质、年龄、体重指数(BMI)水平、吸烟年限、吸烟量、胸水脱落细胞异倍体DNA含量及胸水脱落细胞VEGF含量是患者中位生存时间的影响因素。见表1。

表1 患者基本人口学和病理特征与中位生存时间的关联〔M(Q1～Q3)，个月〕

2.3.2NSCLC纵隔淋巴转移潜在影响因素分析 单因素分析结果提示，与NSCLC纵隔淋巴转移有关的潜在危险因素包括男性、吸烟年限增加、吸烟量增加、出现血性胸水及胸水脱落细胞二倍体DNA含量低、异倍体DNA含量高和VEGF含量低；进一步在单因素分析基础上行多因素回归分析，表明吸烟量增加、出现血性胸水及胸水脱落细胞二倍体DNA含量低、异倍体DNA含量高和VEGF含量低为NSCLC纵隔淋巴转移的独立危险因素。见表2。

表2 NSCLC纵隔淋巴转移潜在影响因素的单因素和多因素分析

2.3.3NSCLC纵隔淋巴转移患者生存曲线比较 由图3和图4可以看出，胸水含有血性成分组的胸水脱落细胞异倍体DNA含量(χ2=11.264，P<0.05)及VEGF含量(χ2=16.946，P<0.05)的NSCLC纵隔淋巴转移患者其整体生存时间均短于不含有血性成分组及低水平组的患者，且均具有统计学意义，因此可以认为高水平VEGF含量、胸水含有血性成分是NSCLC纵隔淋巴转移患者预后不良的危险因素。

图3 不同胸水成分NSCLC纵隔淋巴转移患者的生存曲线比较

图4 不同胸水脱落细胞VEGF含量NSCLC纵隔淋巴转移患者的生存曲线比较

3 讨 论

本研究结果认为对胸水中血性成分及VEGF含量进行检测有助于了解患者的预后情况。胸水中含有血性成分的患者大多会伴有胸痛的临床表现，预后不良的根本机制可能与神经调节作用有关，其对于神经元钠通道电流具有一定的影响，且在炎症性渗出物压迫神经末梢引起的疼痛具有促进作用。因此，BK、SP可作为高敏感性疼痛应激指标应用于临床疼痛程度的评定中〔9～12〕。VEGF则在调节肌肉收缩具有重要的作用。因此，在肌肉组织损伤引起的疼痛中的检测具有重要的应用价值。

肿瘤的发生目前被认为是多基因联合多阶段变异的结果，有研究提示VEGF基因突变导致其编码的蛋白有更强的激酶活性和催化效率，在多种不同恶性肿瘤的发生和发展中起作用。其可以使胞外的活化信号更加强烈地向胞内表达，从而引发肿瘤细胞持续异常增殖。本研究以患者的胸水脱落细胞研究对象，胸水量本身与患者的病程存在关联，因此通过匹配、分层及多因素分析等设计潜在的混杂。既往研究提示，DNA异倍体对于恶性肿瘤患者预后具有重要诊断价值，并且受到拷贝数变异(CNV)的严重影响〔9,10〕。基因组上长度超过1 kb的片断在不同个体间CNV，其在人类基因组中的分布可影响至少10%的序列，同时也被证实与多种复杂疾病相关。