MicroRNA-184调控Ras/MAPK/ERK途径与老年肾细胞癌肿瘤细胞增殖、迁移及凋亡的关系

鲁广建 狄文玉 张群妹 焦路阳

(新乡医学院第一附属医院 1检验科，河南 卫辉 453100；2病理科；3输血科)

肾细胞癌(RCC)是成人泌尿系统常见的肿瘤之一，约占肾脏恶性肿瘤的90%，发病率为2%～3%〔1〕。全球范围内，RCC约占成年男性恶性肿瘤患者的5%，为男性第7位最常见的癌症；约占女性恶性肿瘤患者的3%，女性最常见癌症第10位〔2〕。肾细胞癌的主要治疗方式包括手术、放疗、化疗、靶向治疗和生物疗法等，其中肾癌根治术是RCC首选的治疗方式〔3，4〕，然而，由于老年恶性RCC患者常常合并慢性基础疾病，导致其生理功能及耐受性明显下降，对于此类患者的治疗需考虑其特殊性〔5〕。因此，寻找RCC发生发展的相关机制具有重要意义。MicroRNA是近年来发现的非编码小分子RNA，长度为19～24个核苷酸，可与靶miRNA的3′端非翻译区互补结合，影响mRNA的翻译过程，抑制蛋白质表达，改变细胞的行为〔6〕。MicroRNA-184(miR-184)与多种肿瘤的发生发展密切相关，Fang等〔7〕的研究表明，长链非编码RNA(LncRNA)尿路上皮癌相关基因(UCA)1通过抑制miR-184表达促进口腔鳞状细胞癌的增殖和顺铂耐药；研究发现，miR-184可通过抑制斯钙素(Stanniocalcin)-2延缓胶质母细胞瘤细胞的增殖，侵袭和迁移〔8〕。Ras/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路在RCC的生长过程当中起重要作用。本研究以RCC ACHN细胞为对象，通过转染miR-184，探讨其对RCC ACHN细胞增殖、迁移和凋亡的影响及相关的分子机制。

1 材料与方法

1.1材料 人RCC细胞株ACHN购自美国ATCC细胞库。miR-184 mimics、miR-NC购自广州睿博生物科技有限公司；RPMI1640、胎牛血清、双抗购自Gibco；AnnexinV-FITC细胞凋亡试剂盒购自上海贝博生物；MTT试剂、BCA试剂盒购自碧云天生物有限公司；ERK、磷酸化(p)-ERK、GAPDH抗体购自Cell Signaling Technology;逆转录试剂盒购自TaKaRa。

1.2细胞培养与转染 ACHN细胞培养于含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI1640培养液并置于37℃、5%CO2培养箱中，每2～3 d进行细胞传代，并取对数期生长细胞实验。细胞以5×104个/孔接种于6孔板中，待细胞完全贴壁后，转染miR-184 mimics、miR-NC，48 h后检测ACHN细胞的转染情况。

1.3MTT实验检测细胞增殖 取对数期生长的ACHN细胞消化，离心后以2×103个/孔的密度接种于96孔板中，24 h后转染miR-184 mimics(miR-184 mimics组)和miR-NC(miR-NC组)，对照组未做任何处理，每组设5个复孔，置于37℃、5%CO2培养箱中。24、48 h后，每孔加入10 μl MTT溶液，继续培养4 h，去除96孔板内培养液，加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)震荡混匀，酶标仪测490 nm处吸光度(OD值)并计算细胞存活率。细胞存活率(%)=(转染组OD-对照组OD)/对照组OD×100%。

1.4划痕实验检测细胞迁移 在6孔板背后划5条平行直线后，以2×105个/孔的密度接种对数期生长的ACHN细胞，待细胞完全贴壁后分别转染miR-184 mimics和miR-NC，对照组未做任何处理。24 h后，观察ACHN细胞的生长状况，用黄枪头在6孔板内垂直于背后横线进行划痕，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后加入无血清的RPMI1640培养基置于37℃、5%CO2培养箱中。分别在0、24、48 h使用倒置显微镜拍照并重复3次，划痕宽度由Image J软件进行测量，计算细胞迁移率。细胞迁移率=(0 h宽度-24 h或48 h宽度)/0 h宽度×100%。

1.5流式细胞术检测细胞凋亡 将对数期生长的ACHN细胞以2×105个/孔的密度接种于6孔板中，细胞贴壁后转染miR-184 mimics和miR-NC，对照组未做任何处理。48 h后将ACHN细胞收集，PBS洗涤后，离心(1 000 r/min，5 min，4℃)。细胞重新混悬后置于流式管中，分别加入5 μl膜联蛋白(Annexin)V和10 μl碘化丙啶(PI)，15 min内流式细胞仪检测。

1.6q-RT-PCR法 收集miR-184 mimics组、miR-NC组和对照组细胞，根据总RNA提取试剂盒说明书提取各组ACHN细胞总RNA，测定浓度后，反转录得cDNA，反应条件：42℃ 10 min，30℃ 20 min，99℃ 5 min，4℃ 5 min，随后进行扩增，反应条件：94℃ 5 min(94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s)重复35个循环，72℃ 10 min，可得Ct值，根据公式2-△△Ct计算可得相对表达量。1%琼脂糖凝胶电泳法检测cDNA中的miR-184表达水平。

1.7Western印迹法 收集miR-184 mimics组、miR-NC组和对照组细胞，提取总蛋白，蛋白浓度由BCA法测定，十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)后转膜，洗膜后1%脱脂牛奶封闭1 h，洗膜后加入GAPDH、ERK、p-ERK抗体，4℃摇床孵育过夜，二抗室温孵育1 h后电化学发光(ECL)显像，所得图像由Image J软件分析各条带灰度值。

1.8统计学处理 采用SPSS22.0软件进行单因素方差、t检验。

2 结 果

2.1miR-184在ACHN细胞中的转染情况 与对照组(1.00±0.29)相比，miR-184 mimics组miR-184表达水平(5.97±0.45)显著升高(t=21.990，P<0.05)，miR-NC组miR-184表达水平(0.98±0.05)无显著性差异(t=0.190，P>0.05)。见图1。表明miR-184在ACHN细胞中转染成功。

图1 凝胶电泳检测miR-184表达

2.2过表达miR-184对ACHN细胞增殖能力的影响 转染24 h后，与对照组〔(91.1±9.2)%〕和miR-NC组〔(89.2±8.0)%〕相比，miR-184 mimics组细胞存活率〔(65.5±3.1)%〕显著下降，差异有统计学意义(t=6.864，P<0.1)；转染48 h后，与对照组〔(82.5±8.2)%〕和miR-NC组〔(80.4±7.9)%〕相比，miR-184 mimics组细胞存活率〔(51.9±2.5)%〕显著下降，差异有统计学意义(t=9.800，P<0.01)。过表达miR-184后，可显著抑制ACHN细胞的增殖能力。

2.3过表达miR-184对ACHN细胞凋亡的影响 与对照组〔(6.20±0.30)%〕和miR-NC组〔(6.13±0.23)%〕相比，miR-184 mimics组细胞凋亡率〔(14.01±0.98)%〕显著升高(t=17.504，P<0.05)，见图2。结果显示，过表达miR-184后，促进了ACHN细胞的凋亡。

图2 过表达miR-184对各组细胞凋亡的影响

2.4过表达miR-184对ACHN细胞迁移能力的影响 见图3。

图3 转染后不同时间过表达miR-184对细胞迁移的影响

转染24 h后，与对照组〔(0.98±0.08)%〕和miR-NC组〔(0.97±0.06)%〕相比，miR-184 mimics组细胞划痕宽度变化〔(1.10±0.07)%〕明显增加(t1=2.524，t2=3.153，均P<0.05)；48 h后，与对照组〔(0.76±0.05)%〕和miR-NC组〔(0.78±0.03)%〕相比，miR-184 mimics组细胞划痕宽度变化〔(0.91±0.04)%〕显著增加(t1=5.238，t2=5.814，均P<0.05)。过表达miR-184后，抑制了ACHN细胞的迁移能力。

2.5过表达miR-184对Ras/MAPK/ERK信号通路的影响 与对照组和miR-NC组相比，miR-184 mimics组p-ERK蛋白表达水平显著下降(P<0.05)；与对照组和miR-NC组相比，miR-184 mimics组p-ERK/ERK相对表达量显著下降，见表1、图4，表明ERK激活受到抑制，即过表达miR-184可抑制Ras/MAPK/ERK信号通路。

表1 各组p-ERK蛋白、p-ERK/ERK比较

图4 Western印迹检测各组蛋白表达水平

3 讨 论

全球每年诊断为肾恶性肿瘤的约有20万人，且发病率逐年升高〔9〕。RCC位于我国泌尿系统肿瘤发病率的第二位，随着年龄的增长，发病率逐渐增加〔10〕。Suen等〔11〕对3 535例老人的尸检表明，RCC发病率最高的年龄段是70～75岁，男性高于女性。李东阳等〔5〕对中青年RCC和老年RCC的临床资料进行对比后发现，老年RCC患者病理组织学类型中进展型比例、术中出血量及术后住院时间均高于中青年患者高，严重影响了老年RCC患者的生存质量和预后，因此，深入了解老年肾细胞癌的发生发展具有重要意义。治疗RCC首选根治性手术治疗，但是术后仍有三分之一患者发生进展，且由于对化疗和放疗敏感性差，RCC患者的5年生存率低于10%，中位生存率仅为5年〔3,4〕。因此，从基因分子水平等方面研究RCC极其重要。

MicroRNAs是一类广泛存在于动物和植物细胞内的非编码基因，通过调控基因表达网络调节细胞的增殖、迁移、分化和凋亡等过程〔12〕。近年来，研究发现miRNA在胃癌、胶质瘤等多种肿瘤过程中起到重要作用，而不同的miRNAs各自发挥着抑癌或促癌作用〔13,14〕。秦丹丹等〔15〕的研究发现，在RCC组织中存在miR-30a低表达，与RCC患者的预后相关，且miR-30a可通过MTDH抑制RCC细胞的增殖;张欢等〔16〕采用miRNA芯片检测RCC的肿瘤组织和血清发现存在miR-106a表达升高;杨益等〔17〕发现miR-21 在RCC患者手术前高表达，术后表达水平降低，但其作用机制尚不清楚。本研究以对RCC ACHN细胞为研究对象，成功转染了miR-184，实验结果显示miR-184抑制了细胞的增殖能力和迁移能力，同时促进了细胞凋亡。Wang等〔18〕研究显示，miR-184通过下调C-MYC和BCL-2抑制人结肠癌SW480和HCT116细胞的增殖并促进其凋亡，这与本研究结果一致。

MAPK是与细胞生长、有丝分裂、发育、分化和凋亡等各种生理过程相关的信号转导通路，同时也参与调控肿瘤细胞的增殖、分化、迁移、侵袭及凋亡等过程〔19〕。Ras/MAPK/ERK信号通路，即Ras/Raf/MEK/ERK信号通路可根据MAPK三级激酶模式活化，Ras激活后为磷酸化的Raf，与RAF结合的同时磷酸化Raf，p-Raf激活MEK后，磷酸化的MEK激活ERK，磷酸化的ERK进入细胞核后启动转录。在许多肿瘤中常见MAPK信号通路的异常激活。夏迎晨等〔20〕的研究显示miR-145通过MAPK信号通路调控肺癌A549细胞的转移和侵袭；在RCC中上调ERCC6L可增强体外细胞活力，促进体内肿瘤生长，这一作用可能于调节MAPK信号通路有关〔21〕。本研究结果显示过表达miR-184抑制p-ERK/ERK相对表达量，Ras/MAPK/ERK信号通路受到了抑制。因此推测miR-184抑制ACHN细胞增殖、迁移及促进凋亡的作用可能与抑制Ras/MAPK/ERK信号通路有关。

综上所述，miR-184可能通过调控Ras/MAPK/ERK途径抑制老年肾癌ACHN细胞增殖能力和迁移能力，促进ACHN细胞的凋亡作用，为老年RCC的分子治疗提供一个新思路，也为MicroRNA的临床应用提供理论依据。miRNA-184对RCC的具体作用机制及生物学功能仍需进一步研究。