姜黄素对结直肠癌小鼠肿瘤生长的抑制作用及其PTEN/PI3K/Akt 信号通路机制

裴永彬, 王桂琦, 李 卫, 姜 霞, 姜海波, 赵增仁

（河北医科大学第一医院普外三科，河北 石家庄 050031）

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，发病机制复杂，其发生发展涉及多系统多组织的动态变化过程，多种信号通路参与结直肠癌的发病过程。在众多分子机制中，第10 号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白的同源基因 （phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）/磷酯 酰 肌 醇-3 激 酶 （phosphatidylinositol kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路为非常重要的一环，该信号通路参与结直肠癌细胞增殖、分化、凋亡和转移等多种病理过程，抑制该信号通路对抑制结直肠癌生长具有重要意义［1］。姜黄素为一种植物多酚，从植物姜黄根茎中提取，具有抗氧化、抗炎、抗动脉硬化、降血脂和抗肿瘤等多种药理作用［2］。姜黄素的抗肿瘤作用是通过抑制肿瘤增殖和促进肿瘤凋亡实现的［3］。姜黄素可通过多种信号通路发挥其抗肿瘤作用，李 秀 娟 等［4］研 究 发 现：姜 黄 素 可 通 过 抑 制PTEN/PI3K/Akt 信号通路进而抑制食管癌细胞的增殖并促进食管癌细胞凋亡。姜黄素对结直肠癌也具有抑制作用，卢晓云等［5］研究发现：姜黄素可通过抑制上皮间质转化发挥抑制结肠炎相关结直肠癌的作用。但姜黄素对结直肠癌PTEN/PI3K/Akt信号通路的影响尚不清楚。本研究通过接种结直肠癌细胞建立小鼠结直肠癌模型，观察姜黄素对结直肠癌肿瘤生长及PTEN/PI3K/Akt 信号通路的影响，探讨姜黄素抑制结直肠癌的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、细胞、主要试剂和仪器SPF 级BABL/c 小鼠，体质量19～23 g、雌雄各半，购自北京维通利华实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（京） 2012-0001。人结直肠癌LOVO 细胞（上海中科院）。姜黄素（纯度≥95%，美国Sigma公司），RPMI-1640 培养液、胎牛血清和胰蛋白酶（上海安博广利生物科技有限公司），Western blotting 相关试剂（上海碧云天生物技术有限公司），兔抗鼠增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen ，PCNA） 多克隆抗体、兔抗鼠人髓细胞增生原癌基因c-Myc 多克隆抗体、兔抗鼠天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3 （cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase 3） 多 克 隆 抗体、兔抗鼠PTEN 多克隆抗体、兔抗鼠Akt 多克隆抗体和兔抗鼠磷酸化Akt（p-Akt）多克隆抗体（美国CST公司）。BX53显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 实验动物分组及模型制备60 只BABL/c 小鼠随机分为模型组、低剂量姜黄素组、中剂量姜黄素组和高剂量姜黄素组，每组15只。按照文献［6］的方法建立小鼠结直肠癌模型，具体方法：取结直肠癌LOVO 细胞，在RPMI-1640 全培养基中培养和传代，取对数期生长的结直肠癌细胞，调整细胞密度为2×106mL－1，将其接种至小鼠右前肢腋部皮下，每只小鼠接种0.2 mL。接种后7 d，检测每只小鼠腋下肿瘤直径，肿瘤直径＞10 mm 表示造模成功。模型组、低剂量姜黄素组、中剂量姜黄素组和高剂量姜黄素组各建模成功12、14、13 和13 只小鼠。各组小鼠建模成功后处理：低、中和高剂量姜黄 素 组 分 别 给 予25、50 和100 mg·kg－1姜 黄 素 灌胃［7］，共4 周；模型组小鼠给予等量生理盐水灌胃，共4 周。

1.3 各组小鼠肿瘤体积、肿瘤质量和抑瘤率的检测各组小鼠末次灌胃24 h 后，脱颈处死，取出腋部皮下肿瘤组织，游标卡尺测量肿瘤组织长短径，称取肿瘤组织质量，计算肿瘤体积和抑瘤率。肿瘤体积=肿瘤长径×肿瘤短径2/2，抑瘤率=（模型组小鼠肿瘤体积—目标组小鼠肿瘤体积）/模型组小鼠肿瘤体积×100%。

1.4 免疫组织化学染色检测各组小鼠肿瘤组织中PCNA 蛋白表达情况及细胞增殖指数（proliferationindex，PI）取各组小鼠肿瘤组织石蜡切片，常规脱蜡至水，加入H2O2孵育20 min 消除内源性过氧化物酶活性，PBS 缓冲液冲洗，柠檬酸修复抗原，山羊血清封闭10 min，加入一抗兔抗鼠PCNA 多克隆抗体（1∶300）过夜孵育，PBS 缓冲液冲洗，加入HRP 多聚体标记的山羊抗兔IgG 抗体孵育30 min，PBS 缓冲液冲洗，DAB 显色，反应呈棕黄色时终止染色，蒸馏水冲洗，苏木精复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中心树胶封片，显微镜下观察染色情况。结果判定：显微镜下细胞核被染成棕褐色或棕黄色为阳性细胞，在400 倍视野下拍照，计算PI，PI=阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.5 HE 染色观察各组小鼠肿瘤组织病理形态表现取小鼠肿瘤组织，多聚甲醛固定，石蜡包埋，切成后4 μm 厚切片，脱蜡至水，常规HE 染色观察各组小鼠肿瘤组织病理形态表现。

1.6 Western blotting 法检测各组小鼠肿瘤组织中c-Myc、caspase3、PTEN、Akt 和p-Akt 蛋 白 表 达 水平取各组小鼠肿瘤组织100 mg，加入RIPA 研磨碎，提取总蛋白，BCA 法测定肿瘤组织蛋白浓度，取50 μg 蛋白上样，经电泳、转膜、脱脂奶粉封闭，加入一抗兔抗鼠c-Myc 多克隆抗体、兔抗鼠caspase3 多克隆抗体、兔抗鼠PTEN 多克隆抗体、兔抗鼠Akt 多克隆抗体和兔抗鼠p-Akt 多克隆抗体，稀释比例为1∶1 000，过夜孵育，加入二抗（1∶5 000） 孵 育1 h，加 入ECL 显 影，采 用Vilber FusionCapt Advance 软件测定蛋白条带灰度值，以β-actin 为内参。目标蛋白表达水平=目标蛋白条带灰度值/β-actin 条带灰度值。

1.7 统计学分析采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析。各组小鼠肿瘤体积，肿瘤质量，抑瘤率，肿 瘤 组 织PI，肿 瘤 组 织 中c-Myc、 caspase3、PTEN、Akt 和p-Akt 蛋白表达水平，经正态性检验均符合正态分布，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠肿瘤体积、肿瘤质量和抑瘤率各组小鼠肿瘤体积、肿瘤质量和抑瘤率比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，各剂量姜黄素组小鼠肿瘤体积和肿瘤质量均明显降低（P＜0.05）；与低剂量姜黄素组比较，中和高剂量姜黄素组小鼠肿瘤体积和肿瘤质量均明显降低（P＜0.05），抑瘤率明显升高（P＜0.05）；与中剂量姜黄素组比较，高剂量姜黄素组小鼠肿瘤体积和肿瘤质量均明显降低（P＜0.05），抑瘤率明显升高（P＜0.05）。见图1。

图1 各组小鼠肿瘤体积、肿瘤质量和抑瘤率Fig.1 Tumor volumes, tumor weights and inhibitory rates of tumor of mice in various groups

2.2 各组小鼠肿瘤组织中PCNA 蛋白表达情况及PI 免疫组织化学染色结果显示：模型组小鼠肿瘤组织中可见大量PCNA 阳性细胞；与模型组比较，各剂量姜黄素组小鼠肿瘤组织中PCNA 阳性细胞数量明显减少，且呈剂量依赖性。见图2。与模型组（78.56±12.31） 比较，低、中和高剂量姜黄素 组 小 鼠 肿 瘤 组 织PI （62.14±10.36、36.26±9.17 和19.75±5.21）明显降低（P＜0.05）；不同剂量姜黄素组间小鼠肿瘤组织PI 比较差异有统计学意义（P＜0.05），且呈剂量依赖性。

图2 免疫组织化学染色检测各组小鼠肿瘤组织中PCNA 蛋白表达情况（×200）Fig. 2 Expressions of PCNA protein in tumor tissue of mice in various groups detected by immunohistochemistry staining(×200)

2.3 各组小鼠肿瘤组织病理形态表现模型组小鼠肿瘤组织中细胞排列紊乱，核质比例增加，核染色深；与模型组比较，各剂量姜黄素组小鼠肿瘤组织中细胞排列相对整齐，核质比例下降，核染色浅，且呈剂量依赖性。见图3。

图3 各组小鼠肿瘤组织病理形态表现（HE,×200）Fig.3 Pathomorphology of tumor tissue of mice in various groups（HE,×200）

2.4 各组小鼠肿瘤组织中c-Myc、caspase3、PTEN、Akt 和p-Akt 蛋白表达水平各组小鼠肿瘤组织中Akt 蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。 与模型组比较，各剂量姜黄素组小鼠肿瘤组织中c-Myc 和p-Akt 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05），caspase3 和PTEN 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；与低剂量姜黄素组比较，中和高剂量姜黄素组小鼠肿瘤组织中c-Myc 和p-Akt 蛋白 表 达 水 平 明 显 降 低（P＜0.05），caspase3 和PTEN 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；与中剂量姜黄素组比较，高剂量姜黄素组小鼠肿瘤组织中c-Myc 和p-Akt 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05），caspase3 和PTEN 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。见图4 和图5。

3 讨 论

姜黄素是姜黄发挥作用的主要活性成分，具有通经止痛和破血行气等功效，对多种疾病具有治疗作用［8］。本研究结果显示：姜黄素可降低结直肠癌小鼠肿瘤质量和肿瘤体积，抑制结直肠癌肿瘤组织生长。近年来，姜黄素在抗肿瘤方面的作用日益受到重视，在多种恶性肿瘤中，具有诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管生长和抑制肿瘤细胞增殖等作用［9-10］。姜黄素对结直肠癌细胞也有抑制作用，如姜黄素可通过靶向PBK 抑制结直肠癌HCT116 细胞增殖［11］；姜黄素可抑制人结直肠癌细胞上皮间充质转化和迁移［12］。本研究结果与既往研究结果一致，表明姜黄素对结直肠癌的生长具有抑制作用。

本研究结果显示：与模型组比较，各剂量姜黄素组小鼠肿瘤组织细胞排列相对整齐，核质比例下降，核染色浅；肿瘤组织中PCNA 阳性细胞明显降低，呈剂量依赖性；肿瘤组织PI 值降低，c-Myc蛋白表达水平降低，caspase3 蛋白表达水平升高。PCNA 是一种公认的细胞增殖标志物，根据PCNA计算得到的PI 可反应组织细胞的增殖能力［13］。c-Myc 既是一种易位基因，又是一种调节基因，可促进细胞分裂，使细胞无限增殖获得永生化功能，与多种肿瘤的发生发展有关；在恶性肿瘤中c-Myc蛋白表达水平升高，在一定程度上反映细胞增殖能力增强［14］。本研究结果显示：各剂量姜黄素组小鼠肿瘤组织中PCNA 和c-Myc 蛋白表达水平降低及PI 值降低，表明姜黄素具有抑制结直肠癌细胞增殖的作用。caspase 家族是细胞凋亡的关键元件，caspase3 的高表达均可导致细胞凋亡；caspase3 处于细胞凋亡级联反应的下游，是重要的效应型caspase，是细胞凋亡的关键执行者，其活化标志细胞进入不可逆凋亡阶段［15］。本研究中各剂量姜黄素组肿瘤组织中caspase3 蛋白表达水平升高，表明姜黄素可促进结直肠癌肿瘤细胞凋亡，提示姜黄素可通过抑制细胞增殖、促进细胞凋亡发挥对结直肠癌生长的抑制作用。

图4 Western blotting 法检测各组小鼠肿瘤组织中c-Myc 和caspase3 蛋白表达电泳图(A)和直条图（B）Fig. 4 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of c-Myc and caspase3 proteins in tumor tissue of mice in various groups detected by Western blotting method

肿瘤细胞的增殖和凋亡受多种信号通路调控，PTEN/PI3K/Akt 信号通路在肿瘤生长中也发挥重要的调控作用［16］。本研究结果显示：与模型组比较，各剂量姜黄素组小鼠肿瘤组织中PTEN 蛋白表达水平升高，p-Akt 蛋白表达水平降低。PTEN 为抑癌基因，PTEN 表达上调可能是由于PI3K 的活化产物PIP3 去磷酸化，导致细胞内PIP3 水平降低，进而抑制Akt 激活，导致活化的p-Akt 水平降低［17-18］。c-Myc 为PTEN/PI3K/Akt 信 号 通 路 的 下游靶基因，PTEN/PI3K/Akt 信号通路的激活可促进c-Myc 表 达，从 而 促 进 肿 瘤 细 胞 增 殖［19］。caspase3 也 受PTEN/PI3K/Akt 调 控，PTEN/PI3K/Akt 信号通路激活可抑制下游caspase3 蛋白的表达，从而抑制细胞凋亡［20］。在恶性肿瘤发生发展过程中，PTEN/PI3K/Akt 信号通路激活，PTEN 水平降低，p-Akt 水平升高，抑制PTEN/PI3K/Akt 信号通路活化可抑制恶性肿瘤的发生发展。研究［21-22］显示：姜黄素可通过PTEN/PI3K/Akt 信号通路发挥抗肿瘤作用，姜黄素可通过PTEN/PI3K/Akt 信号通路抑制胃癌的生物学活性。本研究中，模型组小鼠肿瘤组织中PTEN 蛋白表达水平降低，p-Akt 蛋白表达水平升高，表明结直肠癌肿瘤组织中PTEN/PI3K/Akt 信号通路激活；姜黄素处理后结直肠癌组织中PTEN 蛋白水平升高，p-Akt 蛋白水平降低，表明姜黄素可抑制PTEN/PI3K/Akt 信号通路激活。结合本研究中姜黄素对c-Myc 和caspase3 的影响，提示姜黄素可能通过抑制PTEN/PI3K/Akt 信号通路激活，导致下游c-Myc 蛋白水平降低、caspase3 蛋白水平升高，进而抑制结直肠癌肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡，发挥对结直肠癌生长的抑制作用。

图5 Western blotting 法检测各组小鼠肿瘤组织中PTEN、Akt 和p-Akt 蛋白表达电泳图(A)和直条图（B）Fig. 5 Electrophoregram (A) and histogram(B) of PTEN, Akt and p-Akt proteins in tumor tissue of mice in various groups

综上所述，姜黄素对结直肠癌的生长具有抑制作用，其机制可能是姜黄素通过抑制PTEN/PI3K/Akt 信号通路激活抑制结直肠癌细胞增殖并促进结直肠癌细胞凋亡。