多配体蛋白聚糖1 对舌鳞状细胞癌CAL27 细胞迁移、侵袭和细胞周期的调控作用

刘 璐, 张天夫, 王晓峰, 孔晨飞

（1. 吉林大学中日联谊医院口腔科, 吉林 长春 130033；2. 吉林大学中日联谊医院科研中心, 吉林 长春 130033）

研究［1-2］显示：口腔癌作为头颈部好发肿瘤，2018 年全球统计共有约354 864 例新发病例和177 384 例死亡病例。病例呈聚集性分布，其中以美拉尼西亚、中南亚和东亚发病率最高。在口腔恶性肿瘤亚型中，90% 为口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma ，OSCC）［3］。尽管现代化治疗方法不断更新，但在过去十年中OSCC 患者术后复发率并未出现降低趋势，5 年存活率也无明显提高。舌鳞状细胞癌作为口腔癌中占比高达41%的肿瘤，其侵袭性不容忽视［4］，局部复发和第二原发肿瘤的发生和转移是其不良预后的主要原因［5］。因此，舌鳞状细胞癌的早期诊断、病情监控和预后判断是其治疗的关键。

多配体蛋白聚糖1（syndecan-1，SDC1）属于Ⅰ型跨膜硫酸肝素类蛋白聚糖，是重要的细胞表面黏附分子，可调节细胞和细胞外基质黏附和细胞迁移，同时也参与肿瘤细胞的增殖和转移［6］。大量研究［7-10］表明：头颈癌、胰腺癌、乳腺癌和结直肠癌中均出现SDC1 的表达失调。浸润性OSCC 组织中SDC1 表达水平明显降低是导致肿瘤进展的关键，但口腔上皮异常增生和OSCC 组织中SDC1 表达水平降低与OSCC 患者临床转归并无密切关联［11］。同时，SDC1 表达也与唇鳞状细胞癌的发生发展有关联［11］。目前，SDC1 在舌鳞状细胞癌中的调控作用及其机制尚不明确。本研究利用前期实验中成功构建的SDC1 重组过表达载体稳定转染CAL27 细胞，探讨SDC1 与CAL27 细胞迁移、侵袭和细胞周期的关系，以期为OSCC 的临床干预治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器人舌鳞状细胞癌CAL27 细胞（美国ATCC 细胞库）。DMEM 培养基（美国Corning 公司），青霉素、链霉素和胎牛血清（美国Gibco 公司），抗Syndecan-1 抗体（英国Abcam 公司），抗β-actin 抗体［美国Proteintech（中国）公司）］，RIPA 裂解液和活性氧（reactive oxygen species ，ROS）检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），Matrigel 基质胶（美国BD 公司），碘化丙啶（propidium iodide，PI） 和RNase（美国Sigma 公司）。Odyssey 红外成像系统（美国Licor Odyssey 公 司），Transwell 小 室 （美 国Corning 公司），流式细胞仪（FC 500MCL，美国Beckman 公司）。

1.2 细胞培养和分组前期实验中成功构建的稳定高表达ptt5-SDC1 的人舌鳞状细胞癌CAL27 细胞作为实验组，稳定转染ptt5 空载体的CAL27 细胞作为对照组。将细胞置于含有10%胎牛血清和1% 青霉素-链霉素的DMEM 高糖培养基中，于37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。

1.3 Western blotting 法检测细胞中SDC1 蛋白表达水平收集2 组细胞，RIPA 裂解液处理得到蛋白裂解物，通过SDS-PAGE 分离，转移到PVDF膜 上，在4℃条 件 下，SDC1 和β -actin 抗 体（1 ∶1 000 稀 释） 孵 育 过 夜，TBST 洗 涤，Odyssey 红外成像系统扫描结果。使用Image J 软件进行灰度分析，以目的蛋白条带灰度值与β-actin 蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白表达水平。

1.4 细胞划痕实验检测细胞划痕愈合率收集细胞，分别以5×105/孔密度接种至6 孔细胞培养板，培养24 h，细胞贴壁生长汇合率接近100%时，用20 μL 枪头在6 孔细胞培养板底部画一条直线，宽度保持一致，PBS 缓冲液冲洗3 次，以去除漂浮细胞，每孔加入无血清培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，分别于0、12 和24 h 在显微镜下观察，采用Image J 软件对划痕愈合面积进行分析，计算12 和24 h 细胞划痕愈合率。划痕愈合率=（0 h 划痕宽度—12 h 或24 h 划痕宽度）/0 h 划痕宽度×100%。

1.5 Transwell 小室实验检测迁移和侵袭细胞数①细胞迁移实验：将细胞按5×105个/孔接种于6 孔细胞培养板中，培养24 h 至细胞完全贴壁。PBS 缓冲液冲洗3 次后用无血清培养基培养12 h。消化细胞，将2.5×104的细胞悬液加入Transwell上室，下室加入750 μL 含10% FBS 的完全培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育48 h。取出小室，吸去上室培养基，PBS 缓冲液洗涤，棉签拭去上室细胞，4%多聚甲醛固定15 min，PBS 缓冲液洗涤3 次，干燥，0.1% 结晶紫染色10 min，PBS 缓冲液洗涤，静置晾干，于显微镜下随机选取视野，拍照计数迁移细胞数。②细胞侵袭实验：预先用无血清DMEM 培养基按4∶1 比例稀释Matrigel 基质胶，包被Transwell 小室底膜，并呈现凝胶状态，其余步骤同细胞迁移实验。

1.6 流式细胞术检测不同细胞周期CAL27 细胞百分率将细胞按5×105个/孔密度接种于6 孔细胞培养板中，培养24 h 至细胞完全贴壁。预冷PBS缓冲液冲洗3 次，胰酶消化贴壁细胞并收集，离心后PBS 缓冲液中洗2 次，加入预冷70%乙醇，固定30 min。PBS 缓冲液冲洗2 次，加入PI（RNase）溶液，缓慢充分重悬细胞沉淀，4℃避光孵育30 min，采用流式细胞仪检测不同细胞周期细胞百分率。

1.7 流式细胞术检测细胞中ROS 水平收集细胞，无血清培养液1∶1 000 稀释2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA），将细胞悬浮于稀释后的DCFH-DA 中，37 ℃、5% CO2培 养 箱 中 孵 育20 min。每5 min 颠倒混匀细胞液，使细胞充分接触探针。无血清培养液洗涤细胞3 次，去除未进入细胞内的DCFH-DA。流式细胞仪检测细胞荧光强度，并以强荧光强度细胞百分率表示细胞中ROS水平。

1.8 统计学分析采用SPSS 21.0 统计软件进行统计学分析。细胞中SDC1 蛋白表达水平、细胞划痕愈合率、迁移和侵袭细胞数、不同细胞周期细胞百分率及细胞中ROS 水平，均以表示，2 组间样本均数比较采用两独立样本t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 SDC1 过表达细胞系的验证Western blotting法检测实验组过表达ptt5-SDC1 的人舌鳞状细胞癌CAL27 细胞中SDC1 蛋白表达水平，结果显示：与对照组比较，实验组细胞中SDC1 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。见图1。

图1 2 组CAL27 细胞中SDC1 蛋白表达电泳图（A）和直条图（B)Fig. 1 Electrophoregram (A) and histogram(B) of SDC1 protein in CAL27 cells in two groups

2.2 2 组CAL27 细胞划痕愈合率对照组12 和24 h 细胞划痕愈合率分别为20.88%±9.88%和58.24%±11.05%，实验组12 和24 h 细胞划痕愈合率分别为8.79%±2.87%和27.58%±6.19%。与对照组比较，实验组12 和24 h 细胞划痕 愈 合 率 明 显 降 低（P＜0.05 或P＜0.01）。见图2。

2.3 2 组CAL27 细胞中迁移和侵袭细胞数与对照组（299.00±73.51）比较，实验组CAL27 细胞中迁移细胞数 （96.67±20.82） 明显减少（P＜0.01）。与对照组（35.33±9.07） 比较，实验组CAL27 细胞中侵袭细胞数（22.33±9.29）明显减少（P＜0.05）。见图3。

图2 2 组CAL27 细胞划痕愈合实验结果(×200)Fig.2 Results of cell scratch healing test of CA127 cells in two groups(×200)

图3 Transwell 小室实验检测2 组CAL27 细胞中迁移（A，B）和侵袭（C，D）情况(×200)Fig.3 Migration(A,B)and invasion(C,D)of CAL27 cells in two groups detected with Transwell chamber assay(×200)

2.4 2 组不同细胞周期CAL27 细胞百分率与对照组比较，实验组G0/G1期CAL27 细胞百分率明显升高（P＜0.05），S 期CAL27 细胞百分率差异无统计学意义（P＞0.05），G2/M 期CAL27 细胞百分率明显降低（P＜0.05）。见表1 和图4。

2.5 2 组CAL27 细胞中ROS 水平与对照组（57.8%±8.51%） 比较，实 验 组CAL27 细 胞中 ROS 水 平 （93.5%±2.70%） 明 显 升 高（P＜0.05）。

表1 2 组不同细胞周期CAL27 细胞百分率Tab.1 Percentages of CAL27 cells in different cell cycles in two groups

图4 流式细胞术检测2 组不同细胞周期CAL27 细胞百分率Fig.4 Percentages of CAL27 cells in different cell cycles in two groups detected by flow cytometry

3 讨 论

口腔癌在世界常见的恶性肿瘤中位于第11 位，虽然全球口腔癌发病率略有下降，但舌癌的发病率却逐渐升高。在最近10 年中，口腔癌年轻患者（尤其是舌癌患者）所占百分率有所增加［12］，且目前常规治疗策略（外科手术切除为主，放化疗为辅）未能明显提高其生存率。不仅如此，在经过治疗后，患者还须面对严重的不良反应，其中包括面部美观、口腔功能及放疗后全身状况的改变［13］。因此，深入探究舌鳞状细胞癌发生发展过程中的相关机制，可以为其早期诊断、早期治疗和病情监测提供有效方案。

细胞表面黏附受体SDC1 是上皮细胞基底外侧表面上的跨膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，参与细胞增殖、迁移和细胞外基质的相互作用［14］。在浸润性皮肤癌、结肠癌和前列腺癌中，SDC1 的表达水平明显降低［15-16］。本课题组在前期研究［17］中发现：SDC1 敲低后的舌鳞状细胞癌CAL27 细胞具有更加明显的迁移和侵袭特性，而SDC1 过表达可诱导CAL27 细胞凋亡，敲除SDC1 则未表现出明显的细胞凋亡，由此推断，SDC1 可能参与了舌鳞状细胞癌的发生发展过程。

本研究中划痕实验和Transwell 小室实验结果显示：过表达SDC1 使CAL27 细胞的迁移和侵袭能力明显减弱，推测SDC1 与口腔鳞状细胞癌的转移和侵袭呈负相关关系。AHMED 等［18］研究显示：OSCC 组织的浸润前沿，细胞膜SDC1 表达降低，且癌细胞中SDC1 的表达也与肿瘤浸润深度呈负相关关系。口腔癌细胞的浸润和转移扩散被认为与SDC1 表达下调有关，其机制在于细胞膜SDC1的丢失会减少上皮细胞的黏附，使其与细胞外基质的连接松弛，细胞间凝聚力降低，从而促进肿瘤细胞的迁移和侵袭［19］。同时，本研究结果显示：SDC1 过表达后，CAL27 细胞分裂间期受到阻滞，在G0/G1期DNA 合成和复制相对减少，细胞在这一阶段受到损伤，可触发细胞内一系列修复反应，但G2期（分裂期） CAL27 细胞百分率明显降低，则说明其修复机制未能完成，最终导致细胞死亡。细胞周期蛋白（Cyclin）和细胞周期蛋白依赖激酶（cyclin dependent kinase，CDK） 被认为是细胞周期调控的关键，Cyclin D 和CDK4/6 在细胞分裂间期即G0/G1期中发挥重要作用［20］，与食道癌、乳腺癌、肺癌和膀胱癌等的发生关系密切［21-24］。Cyclin D与CDK 4/6 结合，通过磷酸化抑癌蛋白RB 及激活释放转录因子E2F1 进而促进细胞由G0/G1期进入S 期［25-26］。由此可以推测，SDC1 与舌鳞状细胞癌细胞中Cyclin D 和CDK4/6 的调节存在关联，但尚未明确其抑制细胞周期所涉及的机制，这也将成为接下来的研究重点。细胞死亡不仅可以通过阻滞细胞周期，也可以通过诱导细胞凋亡的方式，细胞中ROS 水平升高被认为是诱导细胞凋亡的途径之一［27-29］。本研究中，SDC1 过表达的CAL27 细胞产生的ROS 量明显增加。ROS 是一组高活性氧自由基及其衍生物［30］，其介导的主要凋亡途径分为外部途径（细胞表面死亡受体） 和内部途径（线粒体）［31］。外部途径中，ROS 在转录后对细胞型含死亡域的Fas 结合蛋白样细胞白介素1β 转换酶抑制蛋白 （cellular FADD-like interleukin-1β converting enzyme inhibitory protein，c-FLIP） 产 生 负 调 控，从而促进细胞凋亡［32］。在内部途径中，升高的ROS 可降低线粒体膜电位，改变线粒体通透性，导致Cyt-C 和其他促凋亡分子释放到细胞质中，继而含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，caspase-3）级联反应和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（Poly ADP-ribose polymerase，PARP） 被激活，产生细胞凋亡［30］。线粒体作为ROS 产生的主要来源，被认为在介导细胞凋亡中起到更重要的作用［33］。也有研究［34］结果显示：肿瘤细胞通过线粒体途径发生凋亡，与ROS 的产生无关。此外，靶向治疗可能会触发细胞产生ROS，从而降低膜电位触发线粒体介导的细胞凋亡，也可能通过ROS 独立介导的线粒体途径诱导凋亡［31］。口腔鳞状细胞癌中SDC1 与线粒体诱导的细胞凋亡存在何种关联，目前尚无报道，ROS 在细胞凋亡的内外途径中所起的作用有待进一步深入探讨。

综上所述，SDC1 过表达能够抑制舌鳞状细胞癌CAL27 细胞的侵袭和转移，阻滞CAL27 细胞周期于G0/G1期，同时增加细胞中ROS 水平。本研究结果为靶向SDC1 治疗口腔鳞状癌提供了依据，同时为阐明SDC1 在口腔鳞状细胞癌中的调控机制奠定了基础。