Ni2+对钝顶螺旋藻生长及藻胆蛋白含量的影响

赵嶝科，刘 慧，张少斌，陈小杏，刘金洲，辛 桥

(1.沈阳农业大学 生物科学技术学院，辽宁 沈阳 110866； 2.沈阳农业大学 土地与环境学院， 辽宁 沈阳 110866 )

螺旋藻(Spirulina)是一种光合自养的原核生物——蓝藻，其蛋白质含量高达干质量的60%以上，必需氨基酸种类齐全，而且其比例符合人和动物的需要，此外还富含多不饱和脂肪酸、各种维生素、必需微量元素以及叶绿素、类胡萝卜素、叶黄素等天然色素，具有促进生长、抗氧化、增强抵抗力、改善观赏鱼体色等多种作用，广泛应用在功能保健食品、化妆品、水产养殖饲料及饲料添加剂等领域[1-5]。

镍广泛存在于自然界，在土壤、水和空气中都有微量镍的存在，镍是植物、动物(包括人)和微生物等各种生物体的必需微量元素[6-7]。镍作为脲酶、羧肽酶、谷草转氨酶、葡萄糖变位酶等多种酶的辅助因子或激活剂，参与各种酶促反应，具有多种生理功能，如促进植物氮代谢，促进动物对铁的吸收和利用；促进生长激素分泌等[8-9]。植物缺镍，会影响氨基酸代谢，从而抑制营养生长和生殖生长，难以完成生命周期[9-10]。畜、禽等动物缺镍，骨钙下降，骨组织、皮肤以及肝脏异常，生长速度下降，死亡率增加等[6-8]。补充适量的镍，可显著改善镍缺乏症，并促进植物和动物生长[11-12]。然而，随着现代工农业的发展，镍也成为污染环境的重金属元素之一[13]。微藻不仅营养丰富，而且对重金属具有吸附和富集作用，是一种新兴的重金属污染生物修复材料[14]。

微量镍离子(Ni2+)促进铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)等藻类的生长，但高含量的Ni2+则抑制其生长，出现中毒症状，不同藻类适宜生长的Ni2+含量不同[15]。目前，有关Ni2+对螺旋藻生长的影响未见相关报道。笔者研究了不同含量的Ni2+对螺旋藻生长以及藻胆蛋白含量的影响，可为降低螺旋藻生产成本，促进其作为功能保健食品及动物饲料的开发应用，及利用螺旋藻处理水体镍污染提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

直线型钝顶螺旋藻突变株(Spirulinaplatensis,SP-Dz)由中国农业大学馈赠。原始藻株是江西农科院引自印度，原产于墨西哥的藻株SP. D，经多年培养后形成的直线型突变株。

1.2 螺旋藻培养及生长曲线绘制

将钝顶螺旋藻藻种接种于若干个50 mL三角瓶中，添加不同体积的Ni2+母液(NiSO4·6H2O配制)，配制成Ni2+质量浓度分别为0、0.05、0.1、0.3、0.5、1.0 μg/mL的Zarrouk氏培养液[11]，每瓶藻液定容至30 mL，调整藻种接种密度，使藻液的560 nm光密度值(D560)为0.225，每个处理3个平行，置于光照培养箱中培养，温度(28±1) ℃，连续光照。使用722型分光光度计，每日相同时间测定藻液D560，绘制生长曲线[16]。

1.3 藻细胞吸收光谱测定

培养6 d，藻细胞长到D560为0.6～0.8时培养结束，对藻液适当稀释，使各个波长的光密度值为0.6～0.8，使用722分光光度计，分别测定0 μg/mL和0.5 μg/mL Ni2+处理组藻细胞在400～750 nm间的吸收光谱[16]。

1.4 藻胆蛋白含量测定

当培养结束，离心收集藻体，加入10 mL藻胆蛋白提取缓冲液，使用超声波细胞破碎仪，设定超声功率300 W，超声6 s，间隔6 s，重复10次，然后10 000 r/min离心10 min，取上清液，使用分光光度计，分别测定620 nm和650 nm的光密度(D620和D650)，根据经验公式[17]略有修改，分别计算藻蓝蛋白质量浓度(ρ1)、别藻蓝蛋白质量浓度(ρ2)以及藻胆蛋白总质量浓度(ρ3)。

ρ1/mg·mL-1=(D620-0.474×D650)/5.34

ρ2/mg·mL-1=(D650-0.208×D620)/5.09

ρ3/mg·mL-1=ρ1+ρ2

1.5 数据分析

采用Excel 2016和SPSS软件对试验数据进行处理和统计分析，数值均表示为“平均值±标准差”。

2 结果与分析

2.1 Ni2+对螺旋藻生长的影响

Ni2+对螺旋藻生长的影响见图1、图2。由图1可见，培养第1天，D560值没有明显增长，螺旋藻需适应新的培养环境，自培养的第2日开始，螺旋藻生长逐渐加快，不同Ni2+质量浓度处理之间，生长趋势基本相同，但质量浓度为0.5 μg/mL的Ni2+对螺旋藻生长具有显著的促进作用。由图2可见，螺旋藻培养6 d累积的生物量，当Ni2+质量浓度低于0.5 μg/mL时，随质量浓度的增加，螺旋藻累积的生物量逐渐增加，当Ni2+质量浓度为0.5 μg/mL时，螺旋藻累积的生物量最多，与其他处理差异显著(P<0.05)。而Ni2+质量浓度为1.0 μg/mL时，螺旋藻累积生物量虽然高于0 μg/mL，但略低于0.05 μg/mL(经典Zarrouk培养基中的Ni2+质量浓度)，表明过高质量浓度的Ni2+不能显著促进螺旋藻生长，还可能会产生抑制作用。

图1 不同质量浓度Ni2+对螺旋藻生长曲线的影响Fig.1 Effect of different concentrations of Ni2+ on growth curve of Spirulina

图2 不同质量浓度Ni2+对螺旋藻累积生物量的影响Fig.2 Effects of different concentrations of Ni2+ on accumulated biomass of Spirulina 不同质量浓度间，柱标小写字母不同，表示差异显著(P<0.05). Means with different letters are significant differences (P<0.05) among different concentrations.

2.2 Ni2+对螺旋藻吸收光谱的影响

由于0.5 μg/mL Ni2+处理能显著促进螺旋藻生长，为了分析镍促进螺旋藻生长的原因，测定了该质量浓度Ni2+对螺旋藻吸收光谱的影响(图3)。由图3可见，不添加Ni2+时，螺旋藻藻细胞的吸收光谱主要有3个吸收峰，分别位于438～442 nm(叶绿素a在蓝紫光区的吸收峰)、610～630 nm(藻蓝蛋白的吸收峰)、674～684 nm(别藻蓝蛋白和叶绿素a在红橙光区的吸收峰)。0.5 μg/mL Ni2+处理的藻细胞，叶绿素a在蓝光区的吸收峰发生了显著的变化，在440 nm的吸收峰消失，取而代之的是，在430 nm左右处出现一个小的吸收峰，在448 nm左右处出现一个大的吸收峰。藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白和叶绿素a在红橙光区的吸收峰没有明显变化。以上结果说明，Ni2+通过改变叶绿素在蓝紫光区域的吸收光谱，影响螺旋藻光合作用，进而影响螺旋藻的生长。

2.3 Ni2+对螺旋藻藻胆蛋白含量的影响

不同质量浓度Ni2+对螺旋藻藻胆蛋白含量的影响见表1。由表1可见，在Ni2+质量浓度为0.05～0.5 μg/mL时，随着Ni2+质量浓度的增加，藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白及藻胆蛋白总质量浓度增加，当Ni2+质量浓度达到1.0 μg/mL时，藻胆蛋白质量浓度开始明显下降，但略高于空白对照。

图3 Ni2+对螺旋藻细胞吸收光谱的影响Fig.3 Effect of different concentrations of Ni2+ on the absorption spectra of Spirulina cells

表1 不同质量浓度Ni2+对螺旋藻藻胆蛋白质量浓度的影响

3 讨 论

3.1 镍对藻类生长的影响

适当含量的镍不仅促进大麦等高等陆生植物生长[18]，而且能促进水生植物水鳖(Hydrocharisdubia)[19]、大型褐藻海带(Saccharinajaponica)[20]以及多种微藻的生长[21]。已有研究表明，0.05 μg/mL的Ni2+可促进绿色巴夫藻(Pavlovaviridis)的生长[22]，促进铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)的生长的Ni2+质量浓度为0.1 μg/mL[23]，促进斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)生长的Ni2+质量浓度为0.1～0.5 μg/mL，镰形纤维藻(Ankistrodesmusfalcatus)和绿球藻(Chlorococcumsp.)生长的最佳Ni2+质量浓度为0.5 μg/mL[21]。本试验表明，Ni2+质量浓度为0.05～1.0 μg/mL时，均能促进螺旋藻生长，提高螺旋藻生物累积量，其中以0.5 μg/mL的促进效果最显著，这一结果与镍对其他微藻生长的影响相似。

3.2 镍对藻类色素及藻细胞光吸收的影响

镍通过影响藻类色素含量以及藻细胞的吸收光谱，影响光合作用，进而影响藻类的生长。0.05 μg/mL的Ni2+提高绿色巴夫藻叶绿素a的含量，从而促进其生长，当Ni2+高于此质量浓度时，叶绿素a含量下降，生长受到抑制[22]。铜绿微囊藻藻细胞有3个吸收峰，分别为叶绿素a在蓝紫光区的吸收峰为438 nm，藻蓝蛋白的吸收峰在616 nm，别藻蓝蛋白和叶绿素a在红橙光区的吸收峰为673 nm，不同质量浓度(0.1～1.0 μg/mL)的Ni2+处理，导致藻细胞所有吸收峰均发生不同程度的红移，别藻蓝蛋白含量下降，导致光吸收强度下降[15]。0.1～0.3 μg/mL的Ni2+提高藻蓝蛋白含量，并提高藻胆蛋白光吸收强度，以0.1 μg/mL Ni2+处理效果最佳，与促进生长的最佳质量浓度相同[15]。当Ni2+质量浓度高于5.0 μg/mL时，处理48 h以上，铜绿微囊藻和集胞藻(Synechocystissp.)叶绿素a含量均下降，藻细胞光吸收强度下降，因而抑制其生长[23]。螺旋藻与铜绿微囊藻同属蓝藻，因而螺旋藻藻细胞的各吸收峰位置与铜绿微囊藻相似，0.5 μg/mL的Ni2+处理，导致叶绿素a的吸收峰发生较大红移。叶绿素a中含有Mg2+，体外试验表明，脱镁叶绿素可以与Ni2+、Cu2+、Co2+等结合，生成叶绿素衍生物[24]，因此在生物体内，Ni2+可能通过离子竞争作用，影响或替代叶绿素a中的Mg2+，从而影响叶绿素a的吸收光谱，进而影响螺旋藻的生长。

0.5 μg/mL的Ni2+处理，显著提高了藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白和藻胆蛋白的含量，但对藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白吸收峰的位置没有显著影响。镍作为脲酶的组分，与氮代谢密切相关，而氮代谢则与蛋白质代谢密切相关[9]，因此，镍可能促进了藻胆蛋白的合成，或者减少了其降解，从而提高了藻胆蛋白含量。当Ni2+质量浓度低时，主要与柠檬酸、苹果酸等有机酸结合，当质量浓度增加时，才会与蛋白质多肽链相结合，因而，低质量浓度Ni2+对藻胆蛋白的吸收光谱没有显著影响。藻胆蛋白作为螺旋藻的光合作用蛋白，其含量变化趋势与螺旋藻累积生物量的测定结果基本一致，藻胆蛋白含量越高，光合作用越强，因而螺旋藻生长越快。

3.3 藻类在水体镍污染修复中的应用

虽然镍是很多生物体的必需微量元素，但超过一定量，同样会造成重金属中毒[13]。根据我国生活饮用水卫生标准(GB 5749—2006)，饮用水镍的极限值为0.02 μg/mL，渔业水质标准(GB 11607—1989)规定的渔业用水镍极限值为0.05 μg/mL。根据铜、钴、镍工业污染源排放标准(GB 25467—2010)，工业排污废水中镍质量浓度极限值为1 μg/mL，工业废水排污以及化肥在农业上的大量应用，会造成局部水域镍超标。水生生物能够耐受一定含量的镍污染，Ni2+质量浓度为0.1～10.0 μg/mL，斜生栅藻、镰形纤维藻以及绿球藻均能生长[21]，大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)在Ni2+质量浓度为0.46 μg/mL[25]，唐鱼(Tanichthysalbonubes)在Ni2+质量浓度为0.927 μg/mL时都能安全生长[26]，但镍可能在这些水体生物中富集和积累，并通过食物链逐级传导，最终可能会威胁人类健康[27]。

利用藻类吸附、吸收水体重金属，不仅可以修复水环境，而且还能回收重金属，节约能源[28]。不同藻类对Ni2+的耐受剂量不同。当Ni2+质量浓度高于0.1 μg/mL时即抑制绿色巴夫藻生长[22]。0.5 μg/mL的Ni2+显著抑制羊角月牙藻(Selenastrumcapricornutum)生物量的积累[29]。1 μg/mL的Ni2+显著抑制铜绿微囊藻的生长[15]。5.8 μg/mL的Ni2+对椭圆小球藻(Chlorellaellipsoidea)的生长有明显的抑制作用,椭圆小球藻24 h对Ni2+的清除率超过95%[30]。在Ni2+质量浓度为0.2～3.2 μg/mL时，镰形纤维藻对镍的吸附和吸收具有质量浓度依赖性，3.2 μg/mL时达到最大值，累积系数达382倍[31]。由此可见，不同藻类可以耐受一定剂量的Ni2+污染，并对Ni2+具有吸附和富集作用。

4 结 论

本试验表明，不同藻类生长所需要的Ni2+最适质量浓度不同，利用低质量浓度Ni2+可提高螺旋藻生物量，降低螺旋藻生产成本，从而促进其在饲料、食品等领域的开发应用。而高达1.0 μg/mL的Ni2+对螺旋藻生长没有抑制作用，说明螺旋藻可以耐受一定剂量的Ni2+，可能应用于Ni2+污染水体的治理等环保领域。