2种升温方式对毛蚶呼吸代谢及免疫相关酶活性的影响

秦艺铭，陈丽梅，李 莉，刘利华，郭永军，高金伟

(1.天津农学院 水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384； 2.山东省海洋生物研究院，山东 青岛 266104 )

毛蚶(Scapharcasubcrenata)属软体动物门、双壳纲、翼形亚纲、蚶目、蚶科、毛蚶属，俗称毛蛤、麻蚶、瓦楞子等[1]，广泛分布于东亚的中国、日本、朝鲜沿岸[2-3]，在中国以莱州湾、渤海湾、辽东湾、海州湾等浅海区资源尤为丰富，其生长的适宜温度为18～28 ℃[4]。毛蚶作为一种体温调节能力极弱的变温动物，其体温主要依赖于周围环境温度。而季节变化和降雨常引起毛蚶周围环境温度的剧烈波动，对其生长和存活造成不利影响[5]。目前，有关温度对毛蚶影响的研究主要包括生长、呼吸代谢和免疫等方面。如姜祖辉等[6-7]分别研究了温度11～17 ℃和15～25 ℃下毛蚶耗氧率和排氨率的变化，发现在试验温度范围内，毛蚶耗氧率和排氨率随温度升高而增大；陈丽梅等[5]报道了温度变化(11～23 ℃)对毛蚶鳃、外套膜和肝胰腺组织中抗氧化酶活性的影响，结果表明，毛蚶3种组织中的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性在试验期间均呈先升后降的趋势。而有关温度变化方式对毛蚶呼吸代谢和免疫相关酶活性影响的研究却鲜见报道。

温度是影响贝类呼吸代谢和酶活性的关键环境因子之一，温度变化会在一定程度上导致贝类呼吸代谢和酶活性的改变。呼吸和排泄是贝类重要的生理活动，呼吸率和排泄率通常被用作表征其生理活动强度的重要指标[8]。而超氧化物歧化酶和过氧化氢酶是贝类抗氧化防御系统中的重要组成部分[9]，能有效地消除活性氧，防止细胞膜系统过氧化作用的发生[10]；酸性磷酸酶和溶菌酶是2种重要的水解酶，在细胞吞噬作用中，通过脱颗粒作用释放到血清中发挥分解和防御的作用[11]。因此，检测和分析生物体呼吸代谢和体内的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶和溶菌酶等酶活性的变化，可以反映出生物体应对环境胁迫的生理生化机制。

笔者用缓慢升温和急剧升温2种升温方式，研究升温对毛蚶呼吸代谢以及肝胰腺组织中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶和溶菌酶等酶活性的影响，以查明毛蚶对温度胁迫的响应机制，为毛蚶的科学养殖提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用毛蚶壳长(4.99±0.48) cm，采自天津滨海新区大神堂海域，清洁壳表污物和附着生物后，暂养于水箱中。暂养期间，连续充气，每日全量换水1次，并早晚各投喂等鞭金藻(Isochrysisgalbana)1次，每次投喂后使水箱内藻类密度达到1×104个/mL。暂养海水盐度27±1，水温(15±1)℃。暂养14 d后，挑选健康个体用于试验。

1.2 试验设计

试验设4个温度梯度：15(对照组)、19、23、27 ℃，每个处理组温度均采用急剧升温和缓慢升温2种升温方式，19、23、27 ℃处理组用加热棒控制温度。每个温度梯度设置3个平行。

急剧升温处理组是将暂养在15 ℃海水中的毛蚶分别转移到温度为19、23、27 ℃的水槽中，每个平行组随机取出1只毛蚶，立即测定其耗氧率和排氨率，并在转移后的0、3、6、12、24、48、72、96 h自每个平行组随机取出2只毛蚶，用于免疫酶活性的检测。缓慢升温处理组升温幅度为1 ℃/12 h，同时达到各预设温度并维持恒定温度3 d后，每个平行组随机取出1只毛蚶立即测定其耗氧率和排氨率，另外取出2只毛蚶用于酶活性的检测。

1.3 耗氧率和排氨率的测定

试验以1 L广口瓶为呼吸瓶，每瓶放1只生存状态良好、规格一致的毛蚶，加满海水后立即用保鲜膜封口。每组试验呼吸瓶的水环境与各处理水槽中水环境相同，以不加毛蚶的呼吸瓶作为对照。以毛蚶放入试验水体张壳为起始时间计时，试验持续2 h。

溶解氧的测定采用Winker碘量法，NH4-N质量浓度则采用次溴酸钠氧化法测定(GB/T 12763.4—2007)。试验结束后，用游标卡尺测定毛蚶的壳长(cm)和壳宽(cm)，取软体部组织于60 ℃下烘干至恒定质量。根据试验前后水体中溶解氧和NH4-N质量浓度的变化，按下式计算毛蚶的耗氧率[OR，mg/(g·h)] 和排氨率[NR，μmol/(g·h)]：

OR=(ρ0,DO-ρt,DO)V/(m×t)

式中，ρ0,DO和ρt,DO为试验开始和结束时水体中溶解氧质量浓度(mg/L)的变化，V为呼吸瓶中水体的体积(L)，m为毛蚶软组织干质量(g)，t为试验持续时间(h)。

NR=(ρt,NH4-N-ρ0,NH4-N)V/(m×t′)

式中，ρ0,NH4-N和ρt,NH4-N为试验开始和结束时水体中NH4-N质量浓度(mg/L)的变化，V为呼吸瓶中水体的体积(L)，m为毛蚶软组织干质量(g)，t′为试验持续时间(h)。

Q10=(M2/M1)10/ (θ2-θ1)

式中，Q10为温度对毛蚶代谢的影响强度，M1和M2分别为试验温度(θ1)和试验温度(θ2)时毛蚶的代谢率耗氧率或排氨率。

O∶N=(OR/16)/(NR/14)

式中，O∶N为毛蚶呼吸氧原子数与排出氨态氮原子数之比。

1.4 免疫酶活性的测定

解剖毛蚶，取其肝胰腺组织用0.86%生理盐水清洗，经液氮速冻后-80 ℃保存，待样品全部采集完成后统一测定。测定时加入其组织质量9倍体积的生理盐水，冰浴中研磨，所得的组织匀浆，4 ℃ 3000 r/min离心10 min，取上清液，将6只毛蚶肝胰腺组织的上清液以相同比例混合后于-80 ℃保存备用。超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶和溶菌酶等免疫酶活性以及蛋白质含量均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行测定，具体方法参见试剂盒使用说明。

1.5 数据分析

试验所得数据使用SPSS 20.0和Origin 8.0软件进行分析和作图，采用单因素方差分析进行数据分析，通过Duncan多重比较法分析2种升温方式下毛蚶耗氧率、排氨率和酶活性的差异，以P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 2种升温方式对毛蚶呼吸代谢的影响

2.1.1 2种升温方式对毛蚶耗氧率和排氨率的影响

单因素方差分析表明，温度对毛蚶的耗氧率和排氨率有极显著影响(P<0.01)。在试验温度范围内，2种升温方式下，毛蚶耗氧率和排氨率的变化趋势相似，均表现为随温度的升高先升后降，于23 ℃达到最大值(图1)。

急剧升温方式下，23 ℃处理组中毛蚶耗氧率显著高于15、19、27 ℃处理组(P<0.05)，且15、19、27 ℃处理组间毛蚶耗氧率差异不显著 (P>0.05)。缓慢升温方式下，23 ℃处理组中毛蚶耗氧率显著高于19 ℃处理组(P<0.05)，与15、27 ℃处理组间毛蚶耗氧率差异不显著 (图1a，P>0.05)。2种升温方式相比较，23 ℃急剧升温与缓慢升温方式间毛蚶耗氧率差异极显著 (P<0.01)，19、27 ℃ 2种升温方式间毛蚶耗氧率差异不显著 (P>0.05)。

急剧升温方式下，23 ℃处理组中毛蚶排氨率显著高于其他3个温度处理组(P<0.05)；27 ℃处理组中毛蚶排氨率与15 ℃对照组相比差异显著(P<0.05)，与19 ℃处理组相比差异不显著 (P>0.05)。

图1 2种升温方式对毛蚶耗氧率(a)和排氨率(b)的影响Fig.1 Effects of two warming patterns on oxygen consumption rates (a) and ammonia excretion rates (b) of ark shell S. subcrenata 大写字母“A、B、C”表示急剧升温方式下不同温度处理组各数据存在显著性差异(P<0.05)，小写字母“a、b、c”表示缓慢升温方式下不同温度处理组各数据存在显著性差异(P<0.05). “A, B, and C” indicate significant differences among groups under rapid warming (P<0.05), “a, b, and c” indicate significant differences among groups under slow warming (P<0.05).

缓慢升温方式下，23 ℃处理组中毛蚶排氨率与27 ℃处理组差异显著 (P<0.05)，与15、19 ℃处理组差异不显著 (P>0.05)。2种升温方式相比较，19 ℃急剧升温与缓慢升温方式间毛蚶排氨率差异显著 (P<0.05)，23、27 ℃ 2种升温方式间毛蚶排氨率差异极显著 (P<0.01)。

2.1.2 2种升温方式对毛蚶代谢率Q10值的影响

2种升温方式下毛蚶耗氧率Q10值和排氨率Q10值在19～23 ℃最大，其中急剧升温方式下毛蚶耗氧率Q10值和排氨率Q10值分别为11.84和8.75(表1)，缓慢升温方式下毛蚶耗氧率Q10值和排氨率Q10值分别为4.64和2.43(表2)。急剧升温方式下毛蚶耗氧率Q10值和排氨率Q10值在23～27 ℃最小，分别为0.34和0.18。缓慢升温方式下毛蚶耗氧率Q10值在15～19 ℃最小，为0.43；排氨率Q10值在23～27 ℃最小，为0.04。

表1 急剧升温对毛蚶代谢率Q10的影响

表2 缓慢升温对毛蚶代谢率Q10的影响

2.1.3 2种升温方式对毛蚶O∶N的影响

在试验温度范围内，毛蚶O∶N为0.64～5.33(表3)。急剧升温与缓慢升温方式下毛蚶O∶N均在19 ℃最小，分别为0.64和1.12。急剧升温方式下毛蚶O∶N在15 ℃有最大值，为2.14；缓慢升温方式下毛蚶O∶N在27 ℃有最大值，为5.33。

表3 2种升温方式对毛蚶O∶N的影响

2.2 2种升温方式对毛蚶免疫相关酶活性的影响

2.2.1 缓慢升温方式对毛蚶免疫相关酶活性的影响

缓慢升温方式对毛蚶肝胰腺中超氧化物歧化酶活性的影响见图2a。在试验温度范围内，毛蚶肝胰腺中超氧化物歧化酶的活性在15 ℃有最大值，并且显著高于19、23、27 ℃处理组(P<0.05)，19、23、27 ℃处理组间毛蚶肝胰腺中超氧化物歧化酶的活性均差异显著(P<0.05)。

缓慢升温方式对毛蚶肝胰腺中过氧化氢酶活性的影响见图2b。在试验温度范围内，毛蚶肝胰腺中过氧化氢酶的活性呈先升后降的趋势，在19 ℃有最大值，并且显著高于23、27 ℃处理组(P<0.05)。15 ℃对照组毛蚶肝胰腺中过氧化氢酶的活性与19、23、27 ℃处理组毛蚶肝胰腺中过氧化氢酶的活性均无显著差异(P>0.05)，23、27 ℃处理组间毛蚶肝胰腺中过氧化氢酶的活性差异不显著(P>0.05)。

缓慢升温方式对毛蚶肝胰腺中酸性磷酸酶活性的影响见图2c。在试验温度范围内，毛蚶肝胰腺中酸性磷酸酶活性在15 ℃有最大值，并且显著高于19、23、27 ℃处理组(P<0.05)，19 ℃处理组毛蚶肝胰腺中酸性磷酸酶活性显著低于23、27 ℃处理组(P<0.05)，23、27 ℃处理组间毛蚶肝胰腺中酸性磷酸酶的活性差异不显著(P>0.05)。

缓慢升温方式对毛蚶肝胰腺中溶菌酶活性的影响见图2d。在试验温度范围内，毛蚶肝胰腺中溶菌酶的活性呈先升后降的趋势，在19 ℃有最大值，并且显著高于15、23、27 ℃处理组(P<0.05)，15 ℃对照组毛蚶肝胰腺中溶菌酶的活性显著低于23、27 ℃处理组(P<0.05)，23、27 ℃处理组间毛蚶肝胰腺中溶菌酶的活性差异不显著(P>0.05)。

图2 缓慢升温方式下毛蚶超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶和溶菌酶活性的变化Fig.2 Changes in activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), acid phosphatase (ACP) and lysozyme (LSZ) at slow warming 小写字母“a、b、c”表示缓慢升温方式下不同温度处理组各数据存在显著性差异(P<0.05). “a, b, and c” indicate significant differences among groups at slow warming(P<0.05).

2.2.2 急剧升温方式对毛蚶免疫相关酶活性的影响

急剧升温方式对毛蚶肝胰腺中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性的影响见图3a、图3b。15 ℃对照组毛蚶肝胰腺中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性在试验期间基本保持稳定，19、23 ℃处理组毛蚶肝胰腺中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性随时间变化趋势不明显，27 ℃处理组毛蚶肝胰腺中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性呈先升后降的变化趋势，在6 h达到峰值，并显著高于对照组(P<0.05)。

急剧升温方式对毛蚶肝胰腺中酸性磷酸酶和溶菌酶活性的影响见图3c、图3d。15 ℃对照组毛蚶肝胰腺中酸性磷酸酶和溶菌酶的活性在试验期间基本保持稳定，19 ℃处理组毛蚶肝胰腺中酸性磷酸酶和溶菌酶的活性随时间变化趋势不明显，23、27 ℃处理组毛蚶肝胰腺中酸性磷酸酶和溶菌酶的活性呈先升后降的变化趋势，在6 h达到峰值，并显著高于对照组(P<0.05)。

图3 急剧升温方式下毛蚶超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶和溶菌酶活性的变化Fig.3 Changes in activities of SOD, CAT, ACP and LSZ at rapid warming 小写字母“a、b、c”表示急剧升温方式下相同取样时间点各数据存在显著性差异(P<0.05). “a, b, and c” indicate significant differences among groups at rapid warming(P<0.05).

3 讨 论

3.1 2种升温方式对毛蚶呼吸代谢的影响

温度是贝类生存环境的关键因素之一，贝类的生长、繁殖和代谢等都与温度密切相关[12]。本试验发现，在试验温度范围内，毛蚶耗氧率和排氨率整体变化趋势为随温度的升高先增后减。这种变化趋势与同为双壳贝类的魁蚶(S.broughtonii)[13]、硬壳蛤(Mercenariamercenaria)[14]、虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)[15]随温度变化的情况相似。海洋生物体内存在着代谢补充途径，当外界环境温度突然升高时，它们会通过代谢补充途径提高自身的代谢率以适应这种变化[16]。而已有研究表明，在适宜温度范围内，贝类代谢率随着温度的升高而增加，超出此范围代谢就会出现异常[14-15,17]。本试验中海水温度超过23 ℃时，毛蚶的耗氧率和排氨率开始降低，说明温度超过23 ℃对毛蚶的呼吸代谢产生了抑制作用。同缓慢升温方式相比，急剧升温方式下毛蚶耗氧率和排氨率更高，意味着毛蚶在水温急剧变化条件下需要消耗更多能量，这与徐东等[18]对虾夷扇贝的研究结果一致。姜娓娓等[19]同样采用了2种升温方式分析温度变化对皱纹盘鲍(Haliotisdiscushannai)耗氧率和排氨率的影响，也得到了类似的结果：温度高于20 ℃时，温度急剧变化组的皱纹盘鲍具有更高的耗氧率和排氨率。

Q10值是反映生物体内反应速度与温度关系的一个指标，表示温度每升高10 ℃所引起的代谢率的变化[8]。研究表明，双壳贝类的Q10值通常为1.0～2.5，平均为2.0[20-21]。从本试验结果来看，毛蚶代谢率的Q10平均值为3.01，19～23 ℃2种升温方式下毛蚶的耗氧率Q10值分别达到了11.84和4.64，排氨率Q10值分别为8.75和2.43，与其他结论值相比，毛蚶的Q10值相对较大，说明毛蚶对温度的敏感性相对较高。有研究表明，Q10值越大，说明该温度范围内，由温度的升高引起的代谢率变化越大[8]。本试验中，19～23 ℃温度区间Q10值高于其他温度区间，说明毛蚶在此区间对温度较为敏感，代谢旺盛。从本试验结果来看，急剧升温方式下毛蚶代谢率Q10值在15～19 ℃、19～23 ℃均高于缓慢升温方式下毛蚶代谢率Q10值，这说明毛蚶生理代谢对温度的剧烈变化较为敏感，这与徐东等[18]得到的研究结果相似。

O∶N是表征动物呼吸底物的重要参数，反映了动物在特定状态下体内的脂肪、糖类和蛋白质代谢的比例关系[22]，是评估动物生理呼吸代谢中能源物质消耗情况的一个重要指标。Mayzaud[23]研究表明，当生物体完全进行蛋白质代谢时，O∶N较低，约为7；Ikeda[24]认为，当生物体由蛋白质和脂肪氧化供能时，O∶N约为24；Conover等[25]研究表明，如果机体耗能主要由脂肪或碳水化合物提供，O∶N将大于24，甚至无穷大。从本试验结果来看，毛蚶O∶N为0.64～5.33，说明毛蚶在本试验过程中主要以蛋白质代谢为主，与王冲等[7]研究结果一致。

3.2 2种升温方式对毛蚶免疫相关酶活性的影响

在逆境下，生物体内产生的自由基大量积累，打破了细胞内原有的动态平衡状态，对细胞产生损伤[26]。而贝类的非特异免疫体系中，抗氧化系统对氧自由基的清除是最重要的[9]。该系统中的超氧化物歧化酶是降解活性氧自由基的第一道防线，可将超氧阴离子自由基转化为过氧化氢或过氧化物；过氧化氢酶再将过氧化氢转化为水和氧气，以减轻自由基对机体的损害[27]。本试验中，在急剧升温方式下，毛蚶肝胰腺中的超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性在27 ℃处理组中随时间变化呈现先升后降的趋势，这种变化趋势与陈丽梅等[5]研究温度突变对毛蚶肝胰腺中这2种酶活性影响的结果一致。这可能是由于高温胁迫下，毛蚶体内的活性氧自由基不断积累，毛蚶启动抗氧化防御系统，通过催化过氧阳离子的歧化反应，消除氧自由基的伤害；随着高温胁迫时间的延长，机体产生过多的活性氧自由基超过其承受上限，从而导致机体抗氧化功能发生紊乱，机体免疫力下降[19]。和其他处理组相比，27 ℃处理组抗氧化酶活性随时间变化趋势最为明显，说明毛蚶在此温度点发生了应激性的生理生化反应；19 ℃和23 ℃处理组中毛蚶超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性随着升温时长的增加也有一定的波动性，但整体来说，其活性变化没有明显的规律。

本试验中，缓慢升温方式下，毛蚶肝胰腺中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性分别为89.26～156.75 U/mg和23.62～27.61 U/mg；急剧升温方式下，毛蚶肝胰腺中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性分别为77.54～178.21 U/mg和4.71～29.85 U/mg。2种升温方式相比，急剧升温方式下毛蚶肝胰腺中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性变化范围更大，波动更剧烈，说明急剧升温对毛蚶肝胰腺中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性的影响更为严重。

酸性磷酸酶和溶菌酶是存在于细胞内溶酶体中的2种水解酶。酸性磷酸酶是溶酶体的标志性酶类，能够催化有机磷酸酯水解，打开磷酸酯键，将磷酸酯根离子释放，进而破坏细菌的细胞壁，对机体起到免疫防御的作用[28]。溶菌酶为碱性蛋白，其作用机制主要在于它能够溶解细菌细胞壁中的肽聚糖成分，从而使细菌的细胞壁破损，细胞崩解[29]。本试验中，急剧升温方式下，23、27 ℃处理组毛蚶肝胰腺中酸性磷酸酶和溶菌酶的活性随时间的变化趋势为先升后降，在6 h达到峰值。姜娓娓等[19]在研究5、10、15、20、25 ℃温度梯度下皱纹盘鲍消化腺中酸性磷酸酶和溶菌酶的活性时，也得到了相同的变化趋势。结合抗氧化酶的活性变化发现，高温胁迫可能同时诱导毛蚶体内抗氧化酶和水解酶等免疫相关酶活性的变化。随着胁迫时间的延长，毛蚶启动免疫防御系统，提高体内免疫相关酶的活性，从而增强机体的免疫防御能力。

本试验中，缓慢升温方式和急剧升温方式下，毛蚶肝胰腺中酸性磷酸酶活性分别为45.67～54.55 U/g和38.08～88.26 U/g。2种升温方式相比，急剧升温方式下毛蚶肝胰腺中酸性磷酸酶活性变化范围更大，波动更剧烈，说明急剧升温对毛蚶肝胰腺中酸性磷酸酶活性的影响更为严重。缓慢升温方式和急剧升温方式下，毛蚶肝胰腺中溶菌酶活性的变化分别为0.66～14.52 μg/mg和0.66～2.31 μg/mg。2种升温方式相比，急剧升温方式下毛蚶肝胰腺中溶菌酶的活性数值偏小，说明急剧升温严重抑制了毛蚶肝胰腺中溶菌酶的活性。

综上所述，2种升温方式对毛蚶呼吸排泄以及超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶和溶菌酶等免疫相关酶活性均会产生显著影响，且急剧升温比缓慢升温对毛蚶的影响更加明显。在毛蚶的养殖生产及运输中，应当尽量避免环境温度的剧烈波动，以免引起毛蚶出现强烈应激反应而导致死亡。