紫外线照射对中华锯齿米虾胚胎发育的影响

宋紫玉，王国栋，张丽莉，黄世玉，洪 伟，贾 奔，张元长

(集美大学 水产学院，福建 厦门 361021 )

中华锯齿米虾(Neocaridinadenticulatasinensis)属十足目、匙指虾科、新米虾属，具有生长迅速、生命力顽强等特点，是一种广泛分布于亚洲淡水水域的小型虾。其卵为大型卵，卵径约1 mm，具有抱卵习性，幼体成活率高。因其体色艳丽多彩，经人工培育后成为主要的观赏虾之一[1]。在国内，观赏虾市场越来越受到各方的关注，消费者对其体色的需求也更加多元化。目前的中华锯齿米虾品系都是通过筛选体色自然突变体，经累代人工培育而成。但是自然突变体具有突变概率低，无法进行定向选择等缺点。因此人工诱导是一种较快速产生新体色的方法。可目前尚无人工诱导中华锯齿米虾体色突变体的有关报道。紫外线等高能射线照射受精卵或胚胎是一种人工诱导常用方法。研究表明，紫外线暴露能够引起斑马鱼 (Daniorerio)[2]、青鳉(Oryziaslatipes)[3]和草虾(Palaemonetespugio)[4]等水生动物DNA突变。使用这一方法可以显著提高突变率，快速获得更多的优良变异类型。紫外线诱变处理可导致雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)[5]和豚鼠(Caviaporcellus)[6]中的色素累积，并且可以诱导紫菜(Porphyrahaitanensis)[7]产生可稳定遗传的色素突变体。上述研究表明，紫外线具有诱导产生新体色表型的潜力，可以用来进行观赏虾新体色性状诱导。因此，笔者对中华锯齿米虾不同发育阶段的胚胎进行紫外线暴露处理，计算其的24、48 h半数致死量，为紫外线诱导中华锯齿米虾产生体色突变体提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 亲虾的培育

亲虾培育在50 cm×30 cm×40 cm的玻璃缸中进行。玻璃缸刷洗干净后，在其底部后方隔离出15 cm×30 cm×5 cm空间，填满ADA陶土，用来提供底栖藻类和水草生长的营养盐，并将水体pH维持弱酸性范围。加满经过曝气的自来水，并加入10 mL甲醛消毒。通常添加完甲醛后水体会变得浑浊，待水体变清之后换水1/2，并加入0.5 g的硝化细菌改良水体的微生物菌群。2 d后加入100 g的金鱼藻(Ceratophyllumdemersum)和莫斯[海岛明叶藓(Vesiculariadubyana)]，它们有净化水质、供给氧气、供虾躲藏和美观的作用。挑选体色鲜艳并覆盖全身、体型大的个体用于试验，日投喂2次饲料，饲养温度为25 ℃。

1.2 胚胎的获得

饲养时观察雌虾的性腺发育程度，当性腺向腹部延伸至1/2时视为性腺发育成熟。将性腺发育成熟的米虾，按n(雌虾)∶n(雄虾)=3∶1的比例，进行培育。通常雌雄交配后，在第2天雌虾开始产卵，若雌虾抱卵，则将抱卵虾移入新缸继续培育。

将抱卵虾放在培养皿中观察并确定胚胎的发育时期。用解剖针将胚胎从雌虾腹部剥离，取处于卵裂期、囊胚期、原肠胚期、无节幼体Ⅰ期4个时期的胚胎备用。卵裂期颜色呈黄绿色，细胞较少，内含物较少；囊胚期卵内充满卵黄颗粒，无明显细胞形态；原肠胚期卵一侧卵黄颗粒减少，内陷形成原肠。无节幼体Ⅰ期卵的一端透明略带乳白色，显微镜下可以观察到芽基[8]。

1.3 紫外线暴露

将每个时期的胚胎分为6组，每组设3个平行，每个平行10粒胚胎，试验在培养皿中进行。设置1～6组紫外线照射剂量分别为0、1、2、4、8、16 W·s/cm2。先将紫外灭菌灯预热30 min，再按照设定的紫外线照射剂量梯度照射胚胎。照射10 min后将胚胎放入24孔培养板中，每孔放1粒胚胎并加入灭菌水1.5～2.0 mL。紫外线辐射剂量为紫外灯表面强度和角系数的乘积，表面强度为输出功率与表面积之比，具体计算方法参考文献[9]。

1.4 胚胎体外培养及观察

将装有胚胎的24孔培养板放入人工振荡培养箱(YC-RGZD-4C，常州中诚仪器制造有限公司)中，以速度55 r/min、温度25 ℃、湿度60%培养。日换水2次，换水时，用胶头滴管将卵吸出放入新培养板中，每孔加入灭菌水1.5～2.0 mL。每隔24 h在解剖镜下观察胚胎发育情况、判断其是否死亡，观察至48 h后进行数据分析。出现以下情况之一则认为胚胎死亡：(1)胚胎内含物流出；(2)卵膜破裂；(3)胚胎细胞颗粒界限模糊；(4)胚胎发白且看不到细胞颗粒；(5)无节幼体Ⅱ期之后，心脏停止跳动。

1.5 数据处理

胚胎存活率为胚胎存活数除以本组总胚胎数的百分比。数据用SPSS软件进行统计学分析。首先将存活率进行反正弦平方根处理，再进行方差齐性分析，在此之后进行单因素方差分析，最后用Duncan进行多重比较，并计算其回归关系。P<0.05为具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 不同剂量紫外线对中华锯齿米虾卵裂期胚胎的影响

不同剂量紫外线照射卵裂期的胚胎，培养24 h后存活率见图1。经单因素方差分析发现，紫外线照射剂量(x)对胚胎存活率(y)无显著性差异(P=0.131)。

图1 紫外线剂量对卵裂期胚胎24 h存活率的影响Fig.1 Effect of different UV doses on survival rate of embryos in cleavage stage at 24 hour exposure 不同字母表示存在显著差异(P<0.05)，下同. Different letters in the figure indicate significant differences (P<0.05), et sequentia.

不同剂量紫外线照射卵裂期的胚胎，培养48 h后其存活率见图2。经单因素方差分析发现，紫外线照射剂量对存活率影响显著(P=0.016)。0、2 W·s/cm2组与8、16 W·s/cm2组差异显著，1 W·s/cm2组与其他组均差异不显著，4 W·s/cm2组与16 W·s/cm2组差异显著。

图2 紫外线剂量对卵裂期胚胎48 h存活率的影响Fig.2 Effect of different UV doses on survival rate of embryos in cleavage stage at 48 hour exposure

通过回归方程计算出公式y=-0.0226x+0.7602(r2=0.7776)，则卵裂期48 h半致死剂量为11.5 W·s/cm2。

部分卵裂期胚胎照射后出现畸形，细胞间隙中出现大量透明区(图3)。

图3 卵裂期胚胎紫外线照射后畸形Fig.3 Malformation of embryo in cleavage stage exposed to ultraviolet irradiation

2.2 不同剂量紫外线对中华锯齿米虾囊胚期胚胎的影响

不同剂量紫外线照射囊胚期的胚胎，培养24 h后存活率见图4。经单因素方差分析发现，紫外线照射剂量对存活率影响极显著(P<0.001)。0、1 W·s/cm2组与其他组均差异显著，2 W·s/cm2组与0、1、16 W·s/cm2组差异显著。

图4 紫外线剂量对囊胚期胚胎24 h存活率的影响Fig.4 Effect of different UV doses on survival rate of embryos in blastula stage at 24 hour exposure

通过回归方程计算出公式y=-0.0162x+0.8827(r2=0.7514)，得出囊胚期24 h半数致死剂量为23.6 W·s/cm2。

不同剂量紫外线照射囊胚期的胚胎，培养48 h后存活率见图5。经单因素方差分析发现，紫外线照射剂量对存活率影响极显著(P<0.001)。0、1、2 W·s/cm2组与相邻组外其他组均差异显著，4、8、16 W·s/cm2组间差异不显著。

通过回归方程计算出公式y=-0.0273x+0.7357(r2=0.7326)，则囊胚期48 h半数致死剂量为8.6 W·s/cm2。

部分囊胚期胚胎照射后出现畸形，卵黄细胞颗粒不能充满整个胚胎细胞，在侧面出现透明区(图6)。

图5 紫外线剂量对囊胚期胚胎48 h存活率的影响Fig.5 Effect of different UV doses on survival rate of embryos in blastula stage at 48 hour exposure

图6 囊胚期胚胎紫外线照射后畸形Fig.6 Malformation of embryos in blastula stage after ultraviolet irradiation

2.3 不同剂量紫外线对中华锯齿米虾原肠胚期胚胎的影响

不同剂量紫外线照射原肠胚期的胚胎，培养24 h后存活率见图7。经单因素方差分析发现，紫外线照射剂量对存活率影响极显著(P=0.002)。0 W·s/cm2组和8、16 W·s/cm2组差异显著，1、16 W·s/cm2组与除相邻组外其他组均差异显著。

图7 紫外线剂量对原肠胚期胚胎24 h存活率的影响Fig.7 Effect of different UV doses on survival rate in gastrula embryos exposed to various ultraviolet irradiation doses for 24 hours

通过回归方程计算出公式y=-0.0188x+0.964(r2=0.9364)，则原肠胚期24 h半数致死剂量为24.6 W·s/cm2。

不同剂量紫外线照射原肠胚期的胚胎，培养48 h后存活率见图8。经单因素方差分析发现，紫外线照射剂量对存活率影响极显著(P<0.001)。0、16 W·s/cm2组与其他组均差异显著，2、4 W·s/cm2组间差异不显著，2、4、8 W·s/cm2组之间无显著性差异。

图8 紫外线剂量对原肠胚期胚胎48 h存活率的影响Fig.8 Effect of different UV doses on survival rate in gastrula embryos exposed to various doses of ultraviolet irradiation for 24 hours

通过回归方程计算出公式y=-0.0322x+0.8863(r2=0.9557)，则原肠胚期48 h半数致死剂量为12.0 W·s/cm2。

部分原肠胚期胚胎照射后出现死亡，卵膜破裂不成形，界限模糊(图9)。

图9 原肠胚期胚胎紫外线照射后死亡Fig.9 Dead embryo in gastrula stage after ultraviolet irradiation

2.4 不同剂量紫外线对中华锯齿米虾胚胎无节幼体Ⅰ期的影响

不同剂量紫外线照射无节幼体Ⅰ期的胚胎，培养24 h后存活率见图10。经单因素方差分析发现，紫外线照射剂量对存活率影响不显著(P=0.380)。

图10 紫外线剂量对无节幼体Ⅰ期胚胎24 h存活率的影响Fig.10 Effect of different UV doses on survival rate in nauplius Ⅰ stage for 24 hour exposure

不同剂量紫外线照射无节幼体Ⅰ期的胚胎，培养48 h后存活率见图11。经单因素方差分析发现，紫外线照射剂量对存活率影响极显著(P<0.001)。0 W·s/cm2组与其他组均差异显著，1、2、4、8 W·s/cm2组间差异不显著，8 W·s/cm2组与16 W·s/cm2组差异不显著。

通过回归方程计算出公式y=-0.024x+0.8406(r2=0.8311)，则无节幼体Ⅰ期48 h半数致死剂量为14.2 W·s/cm2。

部分无节幼体Ⅰ期胚胎照射后出现死亡，胚胎发白且看不到细胞颗粒，出现发霉现象(图12)。

图11 紫外线剂量对无节幼体Ⅰ期胚胎48 h存活率的影响Fig.11 Effect of different UV doses on survival rate of nauplius Ⅰ at 24 hour exposure

图12 无节幼体Ⅰ期胚胎紫外线照射后死亡Fig.12 Dead nauplius Ⅰ stage exposed to ultraviolet irradiation

3 讨 论

3.1 胚胎的存活率与紫外线之间具有明显的剂量依赖关系

紫外线照射可以使DNA分子中同一条链相邻的胸腺嘧啶碱基形成以共价键连接成嘧啶二聚体。嘧啶二聚体的积累影响DNA的双螺旋结构，使复制和转录功能受阻，DNA损伤增加[10]。通过研究可得，紫外线照射对中华锯齿米虾胚胎的发育造成影响，且紫外线照射剂量越强，影响越大，胚胎出现畸形和死亡的现象增加。Volz等[4]研究发现，紫外线暴露对草虾的孵化率有明显影响。Sayed等[3]研究发现，青鳉胚胎变形和死亡数量随紫外线照射剂量增加而增加。严正凛等[11]研究发现，紫外线照射剂量对九孔鲍(Haliotisdiversicolorsupertexta)胚胎的孵化率有显著影响。本试验紫外线照射胚胎的结果表明，中华锯齿米虾胚胎的存活率与紫外线具有明显的剂量依赖关系，与上述报道基本一致。

紫外线照射剂量越大，引起的DNA损伤越多。当DNA损伤密度达到一定程度后，将会对功能基因产生影响，加速胚胎死亡，并且DNA修复作用是有限的，当照射剂量过大时，修复作用来不及弥补紫外线造成的损伤，细胞将发生凋亡，致使胚胎存活率降低。

3.2 不同发育时期胚胎对紫外线的敏感性不同

本试验结果显示，处于囊胚期的中华锯齿米虾胚胎对紫外线的敏感程度较高，卵裂期、原肠胚期、无节幼体Ⅰ期的敏感程度较低，并且处于卵裂期和无节幼体Ⅰ期的胚胎，在24 h时对紫外线照射剂量的改变不敏感。Amemiya等[12]研究发现，马粪海胆(Hemicentrotuspulcherrimus)胚胎不同发育时期对紫外线敏感程度也不同。

不同的发育阶段细胞分裂的旺盛程度不同，分裂过程中紫外线照射形成的嘧啶二聚体影响DNA的双螺旋结构，使复制和转录功能受阻，从而导致胚胎畸形和死亡。同时活性氧及氧自由基介导了紫外线引发DNA损伤的过程，促进了二聚体的形成[13]。处于卵裂期的胚胎母源的活性物质较多，对活性氧自由基产生了抑制，因此同样的紫外线照射剂量产生的影响较小。处于囊胚期的胚胎，细胞处于不断地分裂中，紫外线照射引发DNA损伤，进而引起有丝分裂间期DNA复制过程紊乱，致使细胞不能正常分裂，最终胚胎死亡。处于原肠胚和无节幼体Ⅰ期的胚胎，由于细胞开始分化，基因开始表达，消除活性氧自由基的酶活性较高，同样的紫外线照射剂量产生的影响较小。

3.3 随着紫外线剂量的增加胚胎发育延缓

薛俊增等[8]曾报道，中华锯齿米虾自第一次卵裂发育至囊胚期约需47 h，再经33 h后进入原肠胚期，30 h后进入无节幼体Ⅰ期，72 h后进入无节幼体Ⅱ期，50 h后进入无节幼体Ⅲ期，96 h后进入无节幼体Ⅳ期，最后经48 h幼体破膜而出。与上述报道相比，本试验对照组与上述报道发育时间基本一致，试验组随着紫外线照射剂量的增加，胚胎发育有所延缓。研究表明，紫外线照射对牛(Bostaurus)[14]和青鳉[3]的胚胎发育也有延缓作用。

胚胎修复紫外线照射产生DNA损伤需要一定的时间，是胚胎发育延缓的主要原因之一。

3.4 暴露时间对胚胎存活率有影响

在试验过程中发现，可能存在同样的紫外线照射剂量，照射的时间越久，胚胎的存活率越高。有研究表明，通过核苷酸切除修复[15]和碱基切除修复[16]可以修复DNA损伤。但其修复作用有限，同样的紫外线照射剂量，达到该剂量的时间越短，DNA的损伤越难以及时修复，细胞将发生凋亡，致使胚胎存活率降低，畸形率升高。关于暴露时间对胚胎存活率的具体影响还需进一步探究。

本试验结果表明，中华锯齿米虾在不同的紫外线照射剂量下、照射不同时间及不同发育阶段均有一定的存活率，因此推断，紫外线等高能射线照射中华锯齿米虾胚胎是一种可行的人工诱导方法。该研究为紫外线诱导中华锯齿米虾体色突变体的形成工作奠定了必要的基础。