IVF-ET中观察胚胎早期卵裂预测胚胎发育潜力的研究

单旭东 梁 鑫 漆 著 黄明孔

成都中医药大学第二附属医院,四川生殖卫生学院(610041)

如何选择最优质的胚胎进行移植从而获得较高的妊娠率是人类辅助生殖技术(ART)的重要部分。一般选择移植胚胎的方法是在胚胎发育的不同阶段根据胚胎的外部形态对其评分从而得到相对优质的胚胎。由于 ART获得的胚胎有高达 50%可能存在遗传学缺陷[1],现在越来越多的生殖中心尝试通过囊胚移植的方法存优去劣。但囊胚培养的效率低,且存在无囊胚可移植的风险,并不能应用于所有患者。更多的生殖中心仍然选择在第 3天(D3),甚至第 2天(D2)进行胚胎移植,这就要求在胚胎发育的更早期阶段对其进行评价,选择优质可移植的胚胎。对胚胎早期卵裂情况进行观察早在 2001年即被认为是选择D3移植胚胎的有效方法[2],Fisch等[3]在 2003年提出了改进的胚胎评分标准(GES),首次将早期卵裂的观察方法系统地应用于胚胎评分中,以此预测胚胎的发育潜力,在 D3选择出最优秀的胚胎进行移植,并得到了较好的结果。本研究的主要目的在于探讨观察胚胎早期卵裂情况是否能够有效指导临床,得到较高的妊娠率。

1 资料与方法

1.1 研究对象

2008年 12月 29日 ～2010年 1月 1日在本中心进行体外受精 -胚胎移植(IVF-ET)/卵胞浆内单精子注射(ICSI)治疗的 117个周期,女方年龄 32.1±5.5岁。

1.2 方法

1.2.1 促排卵、受精与胚胎观察 采用经典长方案促排卵,月经第 21天注射达必佳 0.1mg/d,至下次月经第 3天根据卵泡情况注射促性腺激素(Gn),当优势卵泡达到 18mm时注射人绒毛膜促性腺激素(hCG),注射后 34～37h取卵,取卵后 3～6h受精。精子密度为(0.1～0.5)×106/m l。胚胎采用微滴培养法,在37℃,5.5%CO2,92%～95%湿度状况下培养至 D3。受精后 17～19h观察原核(PN),23～27h观察早期卵裂(ICSI周期一般在 23～26h,IVF周期在 24～27h),41～42h观察 D2胚胎发育情况,65～67h观察D3胚胎发育情况。

1.2.2 胚胎形态学评分 按照胚胎形态学对胚胎进行评分,包括卵裂球数目、大小、形状、碎片和透明带的厚度及完整性等。胚胎形态学评分标准如下[4,5]：①4分,细胞大小均匀且形状规则,透明带完整,胞质均匀清晰,无颗粒现象,碎片 ＜5%;②3分,细胞大小略不均匀,形状略不规则,胞质可有颗粒现象,碎片10%～20%;③2分,细胞大小明显不均匀,可有形状明显不规则,胞质可有颗粒现象,碎片 21%～50%;④1分,细胞大小严重不均,胞质可有严重颗粒现象,碎片 ＞50%。

1.2.3 优质胚胎选择与移植 对进行了早期卵裂观察的正常受精胚胎(17～19h观察 PN为 2的胚胎)进行分析。D2优胚以当天卵裂球数为 4,评分≥3为标准;D3优胚以当天卵裂球数 7～9,评分≥3为标准[3]。D3结合胚胎发育和评分情况选择优质的胚胎进行移植,移植周期患者 hCG日子宫内膜厚度均 ＞8mm。移植后 14d通过血 hCG确定生化妊娠,移植后 28d通过 B超确定宫内孕囊,可见胎芽及胎心诊断为临床妊娠。

1.2.4 胚胎分组评价 ①按照胚胎的早期卵裂情况,将正常受精胚胎分为 4组,分别为早期卵裂组、未早期卵裂组、PN未消失组和其它胚胎组(包括 23～27h时表现为 1PN或碎片化的胚胎),对各组的 D2、D3优胚率分别进行统计;②根据移植胚胎的早期卵裂情况将移植周期分为 4组：全部移植早期卵裂胚胎组、全部移植未早期卵裂胚胎组、全部移植 PN未消失胚胎组和混合组,对 4组的生化妊娠率、临床妊娠率和种植率以及前 3组中完全移植优胚周期的临床妊娠率(以下简称优胚临床妊娠率,即完全移植优胚周期妊娠数/完全移植优胚周期数 ×100%)和完全移植优胚周期种植率(以下简称优胚种植率,即完全移植优胚周期种植胚胎数/完全移植优胚周期移植胚胎数×100%)等指标进行统计;③根据 D3时移植胚胎中含有优胚的数目,将移植周期分为：移植 2～3个优胚组,移植 1个优胚和 1～2个非优胚组以及未移植优胚组,比较这 3组周期的妊娠率和种植率等。

1.3 统计学方法

数据采用 SPSS 13.0软件进行统计分析,样本阳性率的比较采用 χ2检验。

2 结果

2.1 早期卵裂胚胎与优胚率

正常受精胚胎的 D2、D3优胚率统计结果见表 1。

表 1 早期卵裂与优胚率关系(%)

早期卵裂组和未早期卵裂组的 D2、D3优胚率差异无统计学意义(P＞0.05),但与 PN未消失组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。在早期卵裂组中,早期卵裂数目为 2且评分≥3的胚胎的 D3优胚率最高,为 73.9%;而早期卵裂数目≥3或评分 ＜3的胚胎 D2、D3优胚率较低,其 D3优胚率分别为 27.3%和 33.3%。另外,年龄 ＜35岁和≥35岁患者的胚胎早期卵裂率分别为 26.4%(193/732)和 26.5%(43/162),两者间差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 早期卵裂与妊娠率

在进行了早期卵裂观察的 117个周期中,共 102个周期在 D3进行了鲜胚移植,生化妊娠 53个周期,临床妊娠 43个周期,移植周期生化妊娠率(52.0%)大于同期未进行早期卵裂观察的移植周期生化妊娠率(43.5%)。102个周期共移植 220个胚胎,其中早期卵裂胚胎 79个,未早期卵裂胚胎 63个,PN未消失胚胎 78个。根据移植胚胎的早期卵裂情况将移植周期分组统计,结果见表 2。

表 2 早期卵裂情况与妊娠率的关系

4组患者年龄差异无统计学意义。全部移植早期卵裂胚胎组的生化妊娠率高于另外 3组(P＜0.05),但 4组间临床妊娠率差异无统计学意义(P＞0.05)。全部移植未早期卵裂胚胎组的种植率高于全部移植早期卵裂胚胎组和全部移植 PN未消失胚胎组(P＜0.05),但与混合组差异无统计学意义(P＞0.05)。全部移植早期卵裂胚胎组优胚种植率显著低于全部移植未早期卵裂胚胎组和全部移植 PN未消失胚胎组(P＜0.05)。全部移植 PN未消失组的优胚临床妊娠率显著高于全部移植早期卵裂组和全部移植未早期卵裂组(P＜0.05)。

2.3 优胚率与妊娠率

根据移植周期的优胚情况分组统计结果见表 3。移植胚胎中含有优胚的两组生化妊娠率、临床妊娠率和种植率均显著高于不含优胚组(P＜0.05)。

3 讨论

对胚胎早期卵裂的观察可以有效预见胚胎的发育潜力,对优质胚胎的选择具有重要意义[6]。早期卵裂结合 PN评分或 D2四细胞单核的观察以及囊胚的评分等方法已有所研究[3,7],多数观点认为早期卵裂的胚胎能够得到较高的优胚率或囊胚形成率[2,3],从而可以提高移植的妊娠率。一些报道进行了更细致的研究,将早期卵裂的情况进行了分类和评分,认为只有卵裂时形态正常、碎片少,卵裂数目为 2的胚胎才能得到好的结果[2,3,6,8]。本研究中,24～28h实现了早期卵裂的胚胎在 D3的优胚率显著高于未早期卵裂胚胎和 PN未消失胚胎,但早期卵裂数目≥3或评分 ＜3的胚胎优胚率显著低于卵裂球数为 2且评分 ＞3的胚胎,这与上述观点中早期卵裂可以得到较高优胚率的看法基本相同。

表 3 优胚与妊娠率的关系

另有报道认为早期卵裂仅能预测胚胎的发育潜力,与妊娠结局关系不大[9]。从本文结果看,早期卵裂的形成与患者年龄无关,患者年龄的差异并不能通过早期卵裂的形成影响妊娠率。总结本研究中早期卵裂与妊娠率、种植率的关系后,笔者发现早期卵裂组与未早期卵裂组以及 PN未消失组的生化妊娠率存在差异,但临床妊娠率无差异。仅就 D3优质胚胎而言,PN未消失组的临床妊娠率和种植率等指标反而好于其它周期,单独观察优胚移植周期,早期卵裂组优胚的种植率也显著低于 PN未消失组和未早期卵裂组,而移植了优胚的周期,无论在生化妊娠率、临床妊娠率和种植率上都远优于未移植优胚的周期。可以看出,临床妊娠率与种植率的高低更多取决于优胚而非早期卵裂情况。

分析研究结果,笔者认为通过观察胚胎早期卵裂的方法可以预测胚胎的发育潜能,有效预测优胚率,移植优质的早期卵裂胚胎可以提高生化妊娠率,但对临床妊娠率和种植率的影响不大,决定临床妊娠率和种植率的最具实际意义的指标仍然是优质胚胎。笔者认同对胚胎早期卵裂观察的方法对于 D2进行移植的周期具有一定的意义[10],对 D3及之后的胚胎移植仅起辅助作用,不能单独应用。本文中 PN未消失组的胚胎一旦发育为优胚则具有较高的妊娠率,这可能与胚胎发育中的补偿机制有关,确切原因还需进一步研究。

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2 Fisch JD,Rodriguez H,Ross R,et al.The Graduated Embryo Score(GES)predicts blastocyst formation and pregnancy rate from cleavage-stage embryos[J].Hum Reprod,2001,16：1970-1975.

3 Fisch JD,Sher G,Adamoviczm,et al.The graduated embryo score predicts the outcome of assisted reproductive technologiesbetter than a single day 3 evaluation and achieves results associated with blastocyst transfer from day 3 embryo transfer[J].Fertil Steril,2003,80：1352-1358.

4 陈子江.人类生殖与辅助生殖[M].北京：科学出版社,2005：430.

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6 Ciray HN,Karagenc L,Ulug U,et al.Early cleavagemorphology affects the quality and implantation potentialof day 3 embryos[J].Fertil Steril,2006,85：358-365.

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8 Hardarson T,Hanson C,Sjögren A,et al.Human embryos with unevenly sized blastomereshave lower pregnancy and implantationrates：indications for aneuploidy and multinuc leation[J].Hum Reprod,2001,16：313-318.

9 Summers-Chase D,Horwath D,Yuan W,et al.Pregnancy rates with and without transferring embryos,which showed early cleavage[J].Fertil Steril,2004,82(Suppl 2)：220.

10 Holte J,Berglund L,Milton K,et al.Construction of an evidencebased integrated morphology cleavage embryo score for implantation potential of embryos scored and transferred on day 2 after oocyte retrieval[J].Human Reprod,2007,22：548-557.