中国豫北汉族人群心脑血管疾病患者血管生成素样蛋白4(rs4076317、rs1044250)基因多态性与脂类代谢的关系

王利强，张俊河 ，姚风芹，周绍娟，陈瑞锋，胡蓉蓉

(1.濮阳市安阳地区医院 a.精准医学实验室；b.病案管理科；c.体检中心；d.心内科；e.神经康复科，河南 安阳 455000；2.新乡医学院 生物化学与分子生物学教研室，河南 新乡 453003)

我国心脑血管疾病患病率和死亡率非常高，居我国所有疾病分类中的首位，严重危害人类生命健康[1]。早发现、早诊断、早治疗是降低心脑血管疾病发生和死亡的有效措施。多年来，国内外研究早有发现，心脑血管疾病与脂代谢、基因、环境因素等密切相关[2-3]。血管生成素样蛋白4(angiopoietin-like protein 4，ANGPTL4)是一类新发现的血管蛋白因子，参与脂蛋白代谢调节，对血管生成具有促进作用[4]。据有关文献报道，ANGPTL4rs4076317和rs1044250基因位点，与脂蛋白代谢密切相关，在心脑血管疾病动脉粥样硬化形成中具有重要作用[5-6]。国内外文献研究报道，ANGPTL4基因多态性与脂代谢和心脑血管疾病患者的关系研究结果并不一致[7-10]，国内对ANGPTL4基因多态性与心脑血管疾病的关系研究颇少，杨茜等[11]报道心脑血管疾病组rs4076317、rs1044250与血脂无相关性。我国豫北汉族人群心脑血管疾病患者和健康人群ANGPTL4rs4076317、rs1044250多态性分布频率如何，以及和心脑血管疾病患者脂代谢的关系具体怎么样，均有待进一步研究证实。本研究通过检测ANGPTL4rs4076317、rs1044250两个基因位点多态性，探讨ANGPTL4rs4076317、rs1044250基因位点多态性在豫北汉族人群心脑血管疾病患者和健康人群中的分布频率，进一步分析汉族人群心脑血管疾病患者脂代谢特点，以及ANGPTL4rs4076317、rs1044250基因多态性与脂代谢特点的关系。

1 资料和方法

1.1 一般资料将安阳地区医院2018年12月至2019年12月收治的143例冠心病(coronary heart disease，CAD)住院汉族患者作为CAD组，其中男73例，女70例，平均年龄(59.0±10.6)岁。将安阳地区医院2018年12月至2019年12月收治的130例缺血性脑卒中(ischemic stroke，IS)住院汉族患者作为IS组，其中男67例，女63例，平均年龄(61.7±10.4)岁。将安阳地区医院2018年12月至2019年12月汉族健康体检者115例作为对照组，其中男59例，女56例，平均年龄(60.5±15.3)岁。本研究共纳入研究对象388例，均选自豫北汉族人群。3组研究对象性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。纳入标准：(1)全部病例均为安阳地区医院住院确诊病例，具有典型的临床症状、体征和完善的检查资料；(2)入组对象无传染病、肿瘤、血液病史等。入组研究对象均知情同意，且本研究经医院医学伦理委员会批准通过。

1.2 检测方法

1.2.1血脂水平 测定总胆固醇(cholesterol，CHOL)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)水平。采用分离胶促凝管采集研究对象静脉血液4 mL后，室温放置30 min后，600×g离心5 min后取上清液，采用贝克曼全自动生化分析仪(Beckman Coulter Inc.，USA)分析，所用试剂盒为贝克曼配套试剂盒(Beckman Coulter Inc.，USA)。

1.2.2DNA提取 采集研究对象早晨空腹EDTA-K2抗凝血2 mL，按照DNA提取试剂盒(北京索莱宝公司)操作步骤进行提取，提取完毕，均经电泳验证总DNA提取合格。

1.2.3rs4076317、rs1044250基因位点引物设计和PCR目的片段扩增 设计PCR扩增目的片段引物，引物序列由上海生工生物技术公司合成。见表1。取1.2.2中血液中提取的总DNA，使用PCR仪(西安天隆DTC)扩增目的片段，设置反应条件：95 ℃预变性300 s，随后95 ℃变性45 s，59 ℃退火30 s，共设置35个循环，最后一步72 ℃延伸120 s。扩增完毕后，进行目的片段电泳，观察目的片段大小是否正确，验证正确后，扩增产物送至上海生工生物技术公司测序。

表1 PCR引物序列

2 结果

2.1ANGPTL4rs4076317、rs1044250扩增结果ANGPTL4rs4076317、rs1044250扩增目的产物片段分别为279、210 bp，扩增目的片段正确，电泳结果见图1。

电泳1通道为Marker DL2000；电泳2通道为rs1044250扩增片段210 bp；电泳3通道为rs4076317扩增片段279 bp；ANGPTL4为血管生成素样蛋白4。

2.2ANGPTL4rs4076317、rs1044250基因多态性3组间ANGPTL4rs4076317等位基因位点CC、GC基因型分布频率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；CAD组、IS组ANGPTL4rs4076317等位基因位点CC、GC基因型分布频率与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；CAD组rs4076317等位基因位点CC、GC基因型分别与IS组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。3组间ANGPTL4rs1044250等位基因位点CC、CT基因型分布频率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。CAD组ANGPTL4rs4076317基因CC、GC基因型分布频率危险度OR与对照组比较分析，OR值分别为0.813、1.709，差异有统计学意义(P<0.05)；IS组危险度OR与对照组比较分析，OR值分别为0.787、1.806，差异有统计学意义(P<0.05)。CAD组、IS组CC基因型为避免疾病发生的保护性因素，GC基因型为疾病发生的危险性因素。见表3、4。

表2 ANGPTL4 rs4076317、rs1044250基因多态性分布频率[n(%)]

表3 CAD组与对照组rs4076317等位基因型危险度OR值分析[n(%)]

表4 IS组与对照组rs4076317等位基因型危险度OR值分析[n(%)]

2.3 血脂水平CAD组、IS组ANGPTL4rs4076317基因CC、GC同类基因型所对应的CHOL、TG、LDL-C水平均高于对照组，HDL-C水平均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；CAD组ANGPTL4rs4076317 CC、GC同类基因型对应的CHOL、TG、HDL-C、LDL-C水平与IS组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。3组ANGPTL4rs4076317 CC基因型所对应的CHOL、HDL-C、LDL-C水平与GC基因型比较，差异无统计学意义(P>0.05)；3组ANGPTL4rs4076317 CC基因型所对应的TG水平均低于GC基因型，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。CAD组、IS组ANGPTL4rs1044250基因CC、CT同类基因型所对应的CHOL、TG、LDL-C水平均高于对照组，HDL-C水平均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；CAD组ANGPTL4rs1044250 CC、GC同类基因型所对应的CHOL、TG、HDL-C、LDL-C水平与IS组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。3组ANGPTL4rs1044250 CC基因型所对应的CHOL、TG、HDL-C、LDL-C水平与GC基因型比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表6。

表5 ANGPTL4 rs4076317等位基因多态性与血脂水平比较

表6 ANGPTL4 rs1044250等位基因多态性与血脂水平比较

2.4ANGPTL4rs4076317、rs1044250基因型测序结果扩增目的片段成功后，送上海生工生物技术公司进行测序，随机从标本中抽取ANGPTL4rs4076317、rs1044250等位基因野生型、突变杂合型4例，测序图示例如下图2，黑色箭头所指处为检测位点。

A为rs4076317野生型CC型；B为rs4076317杂合突变型GC型；C为rs1044250 野生型CC型；D为rs1044250杂合突变型CT型；ANGPTL4为血管生成素样蛋白4。

图2ANGPTL4rs4076317、rs1044250基因测序图

3 讨论

ANGPTLs是一类新发现的血管相关蛋白因子，目前已知有7个成员，分别命名为 ANGPTL 1～7，在人类和鼠中均有表达。ANGPTL4在分子结构和氨基酸序列上与血管生成素家族相似，具有一定的同源性。脂代谢紊乱为多基因遗传病，并受其他因素的影响。有关研究证明，ANGPTL4基因多态性与人类的脂代谢相关[12-13]。Muendlein等[5]报道ANGPTL4rs4076317、rs1044250基因多态性与血液中TG水平有关联。Talmud等[9]报道，ANGPTL4rs1044250 (T266M)与血浆低水平的TG和高水平的HDL-C相关，但由于rs1044250与 rs116843064(罕见的E40K变异)存在强的连锁不平衡关系，因此，rs1044250对血脂代谢的影响可能取决于E40K变异。也有研究认为，ANGPTL4基因多态性与脂代谢无关联，Staiger等[10]在对德国白种人群的研究中指出，rs4076317和rs1044250与血浆TG的水平不相关。ANGPTL4基因多态性与脂代谢的关联在多个种族的研究中并不一致，提示各种族的遗传因素仍是产生临床表型差异的原因。ANGPTL4通过抑制脂蛋白脂肪酶影响血脂代谢[7]，研究发现，ANGPTL4基因敲除小鼠TG的水平下降，而通过转基因技术使小鼠体内ANGPTL4过度表达后可观察到TG水平明显升高[14]，人类ANGPTL4基因在TG代谢中是否有同样的作用尚未证实。动脉粥样硬化的形成与高水平CHOL、TG、LDL-C和低水平HDL-C等多种因素有关，是心脑血管疾病发生的高危因素。研究证实，ANGPTL4基因多态性位点与动脉粥样硬化相关疾病的易患性密切相关[6，15]。Muendlein等[5]报道ANGPTL4rs1044250与心血管事件的发病风险相关，rs1044250 T等位基因则是血管事件的危险因素，但携带rs1044250T等位基因的单体型并未观察到增加心血管疾病的发病风险。Folsom等[6]报道，ANGPTL4基因E40K变异与冠心病发生风险增加相关。

本研究检测结果显示，我国豫北健康汉族人群ANGPTL4rs4076317、rs1044250基因多态性，正常野生型分别为79.13%和93.91%，杂合型分别为20.87%和6.09%，两者均未检测到纯合突变型，可能与标本量不足够大有关。在CAD组和IS组中，rs4076317正常野生GG型分别为64.34%和62.31%，杂合GC型分别为35.66%和37.69%，与正常健康人群等位基因频率比较，差异有统计学意义，并且CAD组和IS组中，其rs4076317杂合型GC型与正常对照组比较，危险度OR值分别为1.709、1.806，差异亦有统计学意义，因此，rs4076317杂合型GC型可能是引起心脑血管疾病的易感危险因素，而rs4076317野生型CC型，与正常对照组比较，其OR值分别为0.813、0.787，可能为心脑血管疾病的保护性因素。rs1044250(T266M)在CAD组和IS组中，野生型CC型分布频率分别为93.00%和92.31%，杂合型CT型分布频率分别为7.00%和7.69%，与正常健康人群组比较，差异无统计学意义，可初步认为ANGPTL4rs1044250等位基因多态性在中国汉族人群中与心脑血管疾病易患性无关。本研究数据分析表明，3组患者无论是ANGPTL4rs4076317基因是野生型还是杂合型，其CHOL、TG和LDL-C水平均高于对照组，HDL-C值均低于健康对照组，这些数据进一步证明了CHOL、TG和LDL-C水平偏高、HDL-C水平偏低是心脑血管疾病患者的发病高危因素[16-17]。本研究发现，3组患者ANGPTL4rs4076317，野生型GG与杂合型GC比较，其GG型的TG水平均低于GC型，而CHOL、HDL-C、LDL-C差异无统计学意义，与杨茜[18]报道有所差别，这表明ANGPTL4rs4076317野生GC型较易引起TG增高，可能与心脑血管疾病易感性更密切。

本研究数据分析发现，3组患者ANGPTL4rs1044250基因野生型CC型与杂合型CT型分布频率无差异。ANGPTL4rs1044250基因无论是野生CC型还是杂合CT型，在CAD组、IS组间，其CHOL、TG、HDL-C、LDL-C水平差异无统计学意义，只是在对照组中CC型、CT型，其CHOL、TG、LDL-C水平均低于CAD组和IS组，HDL-C水平高于CAD组和IS组，推测可能原因是ANGPTL4rs1044250基因变异与rs116843064存在连锁不平衡，引起的脂代谢异常更多的是依赖于rs116843064基因变异(罕见的E40K变异)，与Talmud等[9]、杨茜等[11]报道较为一致。

本研究探讨了豫北汉族人群ANGPTL4rs4076317、rs1044250等位基因多态性在正常人群和心脑血管疾病患者人群中的分布频率，还进一步分析了心脑血管疾病人群与健康人群这两个基因位点多态性与脂代谢的关系，初步论证了ANGPTL4rs4076317、rs1044250基因位点变异与脂代谢的关系，进一步论证了ANGPTL4rs4076317基因多态性与脂类代谢TG有关以及ANGPTL4rs1044250基因多态性与脂类代谢无关，并验证了心脑血管疾病患者与正常健康人群脂代谢的水平分布特点。由于心脑血管疾病和脂代谢紊乱是多基因疾病，需要更多的其他基因和其他因素研究，才能更好地阐明基因、脂代谢与心脑血管疾病之间的关系。本研究从ANGPTL4rs4076317、rs1044250两个等位基因位点变异与脂代谢的关系进行研究，为临床分析高脂血症病因提供一定的帮助，可将其作为临床诊治心脑血管疾病的一个风险评估指标，也可为下一步开发ANGPTL4药物治疗心脑血管疾病提供一个方向和途径。由于脂类代谢疾病是多基因病，涉及因素较多，牵涉到多个自变量(疾病、ANGPTL4rs4076317、ANGPTL4rs1044250)和多个因变量(CHOL、TG、HDL-C、LDL-C)，或者其他未知因素等，都可能对脂类代谢指标有影响，鉴于复杂程度，本研究只用了卡方检验和t检验对比分析，未采用多元回归分析方法，可能对本研究的结果稍有影响或存在局限性，有待以后进一步更深入的研究。另外，由于本研究样本量较少，更多的ANGPTL4rs4076317、rs1044250基因位点变异频率分布，以及其他基因与相关的脂代谢和心脑血管疾病的关系，需要更大样本量进行深入的研究。