甲磺酸伊马替尼增强5-氨基酮戊酸光动力疗法对皮肤鳞状细胞癌细胞杀伤作用探讨

张东晨，柳喜凤，李世强，高宝丽，万学峰

（1.保定市第一中心医院，河北 保定 071000；2.新疆医科大学第一附属医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐830054）

近些年临床采用5-氨基酮戊酸光动力疗法（ALA-PDT）治疗日光性角化病和Bowen病，作为一种有效治疗浅表皮肤恶性肿瘤的方法。研究表明PDT治疗Bowen病和日光性角化病1年清除率约为65%～100%[1-2]。由于受到光敏剂吸收及光动力学效应作用病变深度的局限性，其中影响PDT疗效的重要因素之一是病变组织内卟啉物质的蓄积含量[1]。通过增加病变组织中卟啉物质的蓄积可提高PDT的疗效。原卟啉Ⅸ（PpⅨ）是一种底物以ATP依赖性药物外排泵三磷酸腺苷结合盒转运体G2（ABCG2）[3]。ABCG2蛋白主要位于细胞膜，也有报道位于线粒体内膜和细胞系的其他细胞内的隔间。ABCG2蛋白的过度表达，可使源于人细胞系细胞内的PpⅨ荧光降低，与PDT疗效的降低密切相关，当细胞孵育于含ABCG2抑制剂如烟曲霉毒素C[3-5]、Ko-134[6]或甲磺酸伊马替尼[7]时，可逆转ABCG2蛋白的过度表达，从而为提高PDT的疗效提供可能性，因此有必要进行ABCG2蛋白及卟啉类物质对PDT疗效影响的探讨。为此本研究采用人类细胞系[HaCaT表皮角质形成细胞，A431皮肤鳞状细胞癌（cSCC）细胞]，采用ALA处理这些细胞，在有或无ABCG2抑制剂甲磺酸伊马替尼时，对卟啉物质的蓄积、ABCG2蛋白的表达及细胞内卟啉定位进行评估。

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 细胞系 人角质形成细胞HaCaT和人cSCC细胞A431购于武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.1.2 主要试剂 细胞培养用达尔贝科改良Eagles’s培养基（DMEM）培养基和胎牛血清购于Gibco公司，抗体ABCG2（BS-0662R）购自于博奥森，抗体GAPDH（AB-P-R 001）购自于杭州贤至生物有限公司，HRP标记羊抗兔二抗（BA1054）购自于武汉博士德生物工程有限公司，磷酸酶抑制剂（S1873）、RIPA 裂解液（P0013B）、PMSF（ST506）和 BCA 蛋白浓度测定试剂盒（P0010）购自于碧云天，ECL底物液（NCI5079）购自于 Thermo，人原卟啉（EPP）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（ml711200）购自于上海酶联，5-氨基酮戊酸（ALA）购自于复旦张江生物制药股份有限公司，ABCG2抑制剂甲磺酸甲磺酸伊马替尼（Imatinib）购自于瑞士诺华制药有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人类HaCaT角质形成细胞保存于DMEM，内含5%胎牛血清（FCS）和1%非必需氨基酸（NEAA），人cSCC细胞A431接种于DMEM培养基中，其含有10%FCS。细胞在有5%CO2和饱和湿度的恒温培养箱中37℃恒温培养。实验孵育前细胞密度达到 24×104cells/cm2，接种 18～24 h。

1.2.2 细胞蛋白的提取 六孔板培养细胞，在细胞长满的情况下每孔加入100 μL含苯甲基磺酰氟（PMSF，100 mM）的裂解液，于冰上裂解 30 min，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 mL离心管中，于4℃下12 000转/min离心5 min，将离心后的上清分装转移倒0.5mL的离心管中放于-20℃保存备用。

1.2.3 蛋白浓度的测定 将蛋白样品进行10倍稀释，将牛血清白蛋白（BSA）标准品进行稀释，制成蛋白浓度为1，0.8，0.6，0.4，0.2 标准蛋白。将磷酸缓冲盐溶液（PBS）稀释过的蛋白样品、稀释过的标准蛋白分别加入96孔板内，标准品各设2个平行孔，待测样品设3个平行孔，每孔加入体积20 μL。加入PBS的2个平行孔为空白对照。按50∶1比例将BCA试剂盒中A液和B液进行混合，将混合液加入96孔板内，每孔加入200 μL。37℃避光孵育30 min后，用DG-3022A酶标仪测定OD568，根据标准蛋白浓度和相应的OD值计算直线回归方程，根据蛋白样品OD值，利用回归方程计算出样品蛋白浓度。

1.2.4 免疫印迹法（Western blotting）半定量检测目的基因表达 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺（SDSPAGE）凝胶电泳梯度分离目的蛋白后将目的蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脱脂牛奶室温摇床封闭 2 h，分别加入 ABCG2（1∶1 000）和 GAPDH（1∶1 000）抗体 4 ℃孵育过夜，TBST 缓冲液[1]冲洗 6次，5 min/次，加入辣根酶（HRP）偶联二抗（1∶50 000）室温孵育 2 h，TBST冲洗 6次，5 min/次，ECL显影液显影后，X光胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影，冲洗胶片。晾干胶片，扫描胶片，用BandScan分析胶片灰度值。

1.2.5 ELISA法检测 ①样品处理：细胞收集在环氧树脂管中，加入低渗溶液放入液氮3～5 s后提出转入-20℃冰箱（20～30 s），再取出室温解冻，重复3次。3000转/min离心10min，取上清检测。②ELISA法实验步骤：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加标准品和样品稀释液50 μL，余孔分别加标准品或待测样品50 μL。酶标板覆膜后37℃孵育30 min。弃去液体，洗板5次，浸泡30 s/次，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。每孔加酶标试剂50 μL，加上覆膜，37℃温育30 min。弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每孔先加显色液A 50 μL，再加显色液B 50 μL，震荡混匀，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15 min左右。立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度（OD值）。

1.3 统计学分析 采用SPSS20.0软件进行数据的统计学分析，计量资料以（±s）表示，各组间差异采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ALA和甲磺酸伊马替尼对ABCG2表蛋白达的影响 Western blot结果显示，和对照组相比，在HaCaT细胞和A431细胞中，加入ALA（1 mmol/L[2]）处理后，细胞中ABCG2的蛋白表达明显降低；在加入ALA的基础上进一步加入ABCG2抑制剂甲磺酸伊马替尼处理后，细胞中ABCG2的蛋白表达更加显著降低，见图1。用BandScan分析不同处理组中ABCG2蛋白表达的灰度值并进行统计，得出的ABCG2的蛋白相对表达量的统计结果得出相同结论，见图2。

图1 Western blot

图2 Western blot数据统计

2.2 ALA和甲磺酸伊马替尼对细胞中总卟啉量的影响 通过EPP ELISA检测试剂盒的检测结果显示，在人类HaCaT角质形成细胞中，加入ALA（1mmol/L）处理后，细胞中EPP量明显升高；在加入ALA基础上进一步加入ABCG2抑制剂甲磺酸伊马替尼处理后，细胞中总卟啉量更加显著的升高；和HaCaT角质形成细胞相比，在人cSCC细胞A431细胞中，加入ALA（1 mmol/L）处理或在加入ALA基础上联合ABCG2抑制剂甲磺酸伊马替尼处理后，细胞中总卟啉量显著降低，见图3。

3 讨论

cSCC是一种常见的皮肤恶性肿瘤之一，发病率逐年不断升高[8]。临床上常采用液氮冷冻、激光、微波及手术等治疗方法。近些年随着光敏剂的不断发展，为PDT应用于早期cSCC提供了可能，尤其适用于年老体弱合并系统性疾病不宜进行传统手术及非手术治疗的患者，有创伤小及美容效果良好等特点。

图3 ELISA检测结果

本研究通过探讨ALA及甲磺酸伊马替尼对HaCaT细胞和A431细胞内卟啉物质含量的影响以及对ABCG2蛋白表达的影响。在单一ALA作用的情况下，与空白对照组相比，HaCaT细胞和A431细胞中卟啉含量增加；而ALA联合甲磺酸伊马替尼的情况下，较单一使用ALA处理相比，A431细胞中卟啉含量增加更明显。提示ABCG2抑制剂可增强A431细胞对卟啉物质的摄取，而细胞内卟啉物质的含量决定了PDT治疗的疗效。同时采用免疫印迹法检测细胞ABCG2蛋白的表达，与空白对照组相比，ALA可降低A431细胞中ABCG2蛋白的表达，而ALA联合甲磺酸伊马替尼可显著降低A431细胞中ABCG2蛋白的表达，有关ABCG2蛋白表达的研究结果与Bebes等[6]研究一致。由于肿瘤细胞内卟啉物质的含量是PDT治疗的决定性因素之一，ALA作用于A431细胞较空白对照组A431细胞内卟啉物质明显升高，从理论上肯定了PDT治疗cSCC的可能，同时ALA联合ABCG2抑制剂甲磺酸伊马替尼进一步提高A431细胞内卟啉物质含量，为甲磺酸伊马替尼应用于PDT疗效的提高提供了理论依据。而ABCG2蛋白在肿瘤细胞内的过度表达，可使细胞内PpⅨ荧光降低，与PDT疗效的降低密切相关，本研究采用ALA联合ABCG2抑制剂甲磺酸伊马替尼较单一使用ALA，可进一步降低A431细胞内ABCG2蛋白的表达，从而证实ABCG2抑制剂甲磺酸伊马替尼可降低A431细胞内ABCG2蛋白的表达，为提高PDT治疗cSCC的疗效提供理论基础。

总之，本研究表明在HaCaT和A431细胞中，ALA和/或ABCG2抑制剂甲磺酸伊马替尼可提高A431细胞内卟啉物质的含量，同时降低细胞内ABCG2蛋白的表达，从而为ABCG2抑制剂甲磺酸伊马替尼联合ALA可提高PDT的疗效提供了理论依据，但对正常的角质形成细胞无此作用。