纳米硒制备方法、抗氧化作用机制及临床应用研究进展

黄轶驰 ，田红旗

1 北京协和医学院中国医学科学院放射医学研究所，天津30019；2 天津市放射医学与分子核医学重点实验室

硒（selenium，Se）是人体必需的微量元素之一，可维持人体氧化还原平衡，在预防心血管疾病、高胆固醇血症及癌症等疾病中起重要作用［1］。根据美国国家科学院建议，成人每日硒摄取量55～400 μg，每日硒摄取量＞700 μg 时对人体产生毒性，严重时可导致硒中毒［2］。硒中毒主要表现为疲劳及神经、心血管和胃肠系统紊乱等症状。目前，有机硒和无机硒化合物作为硒的膳食补充剂已应用数年，但由于其安全范围极窄，用量不慎极易造成硒中毒［3］；红色的单质硒毒性较低且有一定生物活性，但化学稳定性差，快速受热或室温下容易缓慢聚集成无活性状态［4］。

1997 年，张劲松等［5］首次创造性地将纳米技术应用于红色单质硒的制备，他们引入牛清血白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作为保护剂，成功地制备结构稳定、生物活性高的纳米硒。相较于其他价态的有机硒和无机硒化合物，利用纳米技术制备的红色单质硒不仅生物利用度更高、安全性更好，而且具有良好的抗氧化活性，能显著改善细胞异常的氧化应激状态［6］。现将纳米硒的制备方法、抗氧化活性和作用机制，及其对各组织、器官损伤和相关疾病的防治作用最新研究进展综述如下。

1 纳米硒的制备方法

纳米硒的粒径可影响其生物活性及细胞对其摄取能力［7］。因此，制备合适的纳米粒径和形态，即选取合适的方法至关重要。目前，制备纳米硒的方法主要包括化学、物理、生物（如细菌、真菌、植物等）制备方法三类。

1.1 化学制备方法 化学方法制备的纳米硒通常是通过硒源（如亚硒酸或其盐类溶液）与还原剂（如维生素C、谷胱甘肽等）发生氧化还原反应后制成，但生成的红橙色纳米硒产物具有化学不稳定性，其生物活性和生物相容性大大降低［4］。为得到稳定、均匀分散的纳米硒，常使用稳定剂对制备的纳米硒表面进行修饰。用于纳米硒表面的修饰剂主要有高分子聚合物、糖类、蛋白质、脂质，甚至是药物［2，6，8］等，具有分枝多、富含大量羟基或氨基，能与纳米硒表面发生稳定的静电作用等特点，可阻止硒粒子间的相互聚集，保证纳米硒的高度分散性和稳定性。

通过化学方法得到的纳米硒化学结构稳定、粒径均一，并可通过修饰剂用量和种类变化来调控合成纳米硒在不同环境的释放速率，提高其在人体内的生物利用度和生物活性［7］。ZHAI等［7］使用不同分子量的壳聚糖（chitosan，CS）作为稳定剂，合成外观均匀的球形纳米硒粒子（CS-SeNPs），并发现低分子量CS-SeNPs 比高分子量者结构更为致密，在胃、肠和汗液的模拟环境中硒释放速率更缓慢，但不影响其抗氧化活性。

1.2 生物制备方法 虽然目前化学制备方法应用广泛，但由于其存在如成本昂贵、危险试剂的使用以及对环境造成化学污染等诸多弊端，再加之与现代社会所提倡的“绿色科学”理念相违背，越来越多的研究人员开始聚焦于更为安全、经济和环保的纳米硒生物制备方法。作为化学制备方法的替代品，生物制备方法可利用细菌、真菌等微生物或植物某一部位的提取物得到生源性纳米硒。

1.2.1 利用细菌制备纳米硒 可用于制备纳米硒的细菌包括如Bacillus、Streptomyces、Lactobacillus等的革兰氏阳性菌和如Klebsiella、Idiomarina、Enterobacter、Citrobacter、Pseudomonas 及 Rahnella 等的革兰氏阴性菌［9-12］。

细菌驱动制备纳米硒的机制至今尚未完全明确，可简单概括为以下几个过程：①硒氧阴离子通过各类转运体转运至细胞内；②硒氧阴离子在细胞内发生复杂的氧化还原反应，将高价态硒盐还原为零价硒；③生成的零价硒转运至细胞外；④运用蛋白质、多糖等有机成分物质将零价硒封装成稳定的纳米硒状态。由于细菌的生物多样性和复杂性，纳米硒的制备不一定全部发生在细胞内，也可能在细胞外，甚至是通过膜结合酶完成［12］。这就意味着过程①、③并不是必须的，但过程②、④在纳米硒的合成中是必然存在。因此，蛋白质、多糖等生源性分子在合成纳米硒的整个过程中充当十分重要的角色，除了可以作为一些催化酶系参与硒盐的还原之外［12］，还作为表面修饰剂维持纳米硒的生长和稳定。

细菌制备的纳米硒具有生物相容性更高、毒性更低等优势。但目前采用生物方法存在培养细菌过程繁琐、制备持续时间较长、制备纳米硒质量可控性差以及纳米硒表面成分未知等问题，具体制备方法仍需进一步探索和优化。

1.2.2 利用真菌制备纳米硒 真菌作为一个简单、经济、灵活的生物系统，同样可以作为合成纳米硒的“工厂”，包括 Alternaria、Saccharomyces、Aspergillus、Polyporus、Phanerochaete、Pichia、Pleurotus、Mariannaea、Fusarium、Monascus、Lentinus、Ganoderma Karst等［13-14］。

当硒的表面被真菌的生源性多糖、蛋白质或多糖—蛋白复合物包裹时，整个纳米体系在生理环境中可保持相对稳定，同时更容易被靶细胞摄取，生物活性更强。YANG 等［14］以富有免疫佐剂功能的真菌多糖lentinan（LET）和Tw-80 作为修饰剂，制备了一种新型纳米硒颗粒（LET-Tw-SeNPs），由于其优秀的细胞转运能力和理想的粒子大小，能高效地到达靶细胞部位，并在血液中能较长时间地保持稳定，从而实现对实体肿瘤深度治疗的目的。

1.2.3 利用植物提取物制备纳米硒 叶、果实、果壳、种子等部位常中含有一些如多酚等易氧化性成分，因此植物提取物可用来还原硒盐，最终获得高包裹度纳米硒。与其他生物制备方法比较，植物提取物制备纳米硒所需反应条件简单，价格更低。将Hibiscus sabdariffa叶提取液和亚硒酸溶液在不断搅拌下制得由次级植物代谢物结合的纳米硒，反应条件简单环保，所得纳米产物抗氧化活性较高［15］。

相较于传统的化学制备方法，不论是利用细菌、真菌，还是各种植物提取物制备纳米硒方法，均拥有如操作简便安全、经济、绿色环保等优势，所得的生源性纳米硒稳定性、安全性、生物相容性均更高，但也正因为该独特而又复杂的制备方式，制备过程繁琐、产品质量不可控等弊端也影响纳米硒的产量及临床广泛应用。

1.3 物理方法 物理方法制备得到的纳米硒颗粒尺寸可控，稳定性高，但存在诸如设备条件严苛、合成环境危险等因素，限制其广泛应用。γ-辐射和微波辐射等物理方法常作为化学或生物制备纳米硒的辅助方法，可迅速加快制备反应的进行，提升制备效率，提高纳米硒的产量和质量［16］。与Monascus purpureus制备纳米硒方法比较，1 000 Gy的γ-射线联合Monascus purpureus制备纳米硒的产量提高将近5倍，其原因可能在于γ 射线诱导该真菌细胞产生基因突变，从而导致纳米硒的加倍产生［13］；Mellinas等［4］在使用Theobroma cacao L.豆壳提取物制备纳米硒的过程中使用了微波辐射，不仅有效控制了纳米硒粒径大小，延长其贮存时间，同时制备的纳米硒抗氧化活性高。液体脉冲激光烧浊法（pulsed laser ablation in liquids，PLAL）是一种纳米硒的新型制备工艺，可用于纯裸纳米硒颗粒（没有表面功能化）的制备，通过两次脉冲激光照射得到的纳米硒粒径小、稳定性高，并可发挥多种生物功能［17］。

2 纳米硒的抗氧化作用机制

2.1 清除活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）ROS 是一类性质较为活泼的含氧化合物总称，正常状态下人体内少量的ROS 作为一种传递细胞信号和维持细胞稳态的重要因子，能让机体逐渐适应氧化环境的变化；但在辐射、化学药物、酒精、吸烟、重金属等外部因素的诱导下，高水平ROS 的产生会导致机体的氧化应激，对体内的脂质、蛋白质和核酸等生物重要分子造成损伤，最终造成病理状态［18］。

纳米硒可直接清除ROS。不同分子量CS 修饰得到的纳米硒球形粒子对DPPH，ABTS 等自由基均具有较好的清除能力；且在一定范围内，对皮肤和肠道细胞内ROS 产生的抑制强度取决于纳米材料中硒的浓度，浓度越高，对ROS的抑制强度越大［7］。

2.2 增强酶促抗氧化系统的抗氧化能力 ROS 可以被体内的非酶促抗氧化系统和酶促抗氧化系统清除。非酶促抗氧化系统主要分为水溶性抗氧化剂（如维生素C、尿素等）、脂溶性抗氧化剂（如维生素E、胡萝卜素等）；酶促抗氧化系统包括各种抗氧化酶，如超氧化物歧化酶（superoxde dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）和硫氧还蛋白（thioredoxin，Trx）等。

SOD 和CAT是体内十分重要的抗氧化酶。SOD可将超氧化物自由基（如超氧阴离子）转化为H2O2和水，可充当清除ROS 的第一道防线；而CAT 进一步催化H2O2生成水和氧气［19］。

目前，已有25 种维持体内氧化还原平衡的硒蛋白已被鉴别［20］。其中GPx是人体不可或缺的一类内源性抗氧化酶，可催化GSH 还原H2O2或有机过氧化物生成水或相应的羟基化合物，并受体内硒水平的影响［21］；Trx及其还原酶（thioredoxin reductase，TrxR）参与细胞的凋亡，在机体抵抗氧化应激功能上发挥重要的作用［22］；硒蛋白P（SelP）是一种含数个硒代半胱氨酸残基的重要糖蛋白，不仅具有抗氧化活性，而且可用于硒的转运［20］；硒蛋白S（SelS）主要对糖尿病和心血管损伤具有良好的保护作用；硒蛋白R（SelR）作为唯一一种含Sec 的甲硫氨酸亚砜还原酶，在中枢神经系统中发挥重要功能［22］。

纳米硒可以增强体内酶促抗氧化系统的抗氧化能力。LOESCHNER 等［23］研究发现，纳米硒在大鼠体内与亚硒酸盐具有相似的代谢途径：吸收至体内的纳米硒可能先转化为H2Se，随后被纳入GPx、Trx等各种硒蛋白的活性位点，从而显著提高硒蛋白的活性，保护机体免受氧化损伤。纳米硒颗粒的摄入首先导致人体ROS 水平降低，在发生细胞凋亡之前，通过激活核转录因子Nrf2 刺激下游各种抗氧化酶基因转录，促进人体清除ROS，保护肠道免受氧化应激的损伤［24］。

2.3 抑制细胞凋亡 纳米硒可通过抑制细胞凋亡发挥抗氧化作用。纳米硒可以通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2 和下调凋亡蛋白Bax 的表达，调节线粒体膜通道的渗透性，抑制了如细胞色素c 等的促凋亡蛋白释放至细胞质，从而抑制细胞凋亡的发生［25］。此外，纳米硒可通过调节p38 MAPK/Erk，核转录因子kappa B（NF-κB）、ASK1/JNK、PI3-K/Akt/mTOR 等多条信号通路来抑制氧化应激所诱导的细胞凋亡［25］。

3 纳米硒的临床应用

日常生活中与有毒化学物质、引起严重副作用的药物、重金属、酒精、疾病等危险源过量接触均会引起人体敏感组织和器官的氧化应激，造成一定程度的损伤。纳米硒作为强抗氧化剂单独或提前使用时，能有效地预防或保护不同组织、器官（如睾丸、肝脏等）因过度氧化应激所造成的损伤，并在神经系统疾病、糖尿病等疾病的治疗中具有潜在的优势。作为硒的一种独特形式，单独使用纳米硒在某些情况下治疗效果往往有限。为了更为有效、快速地达到治疗目的，可将纳米硒与治疗药物联合应用，包括与抗氧化剂、降血糖药物等，不仅能通过协同作用，增强药物的治疗效果，也可降低药物的不良作用，减少过量纳米硒产生毒性的风险。

3.1 在生殖系统疾病中的临床应用 睾丸因其膜多不饱和脂质含量高而成为氧化应激的敏感器官［20］，氧化应激进一步会造成睾丸组织的损伤，影响精子的生成和质量。硒不仅是参与雄性生殖中睾酮的生物合成和精子的形成的关键元素［18］，而且其强大的抗氧化活性可以改善性腺的氧化应激状态。而纳米硒的补充可以显著地提高雄性大鼠精液的质量和睾丸组织中抗氧化系统的活性，对生活中各种危险因素（有毒化学物质、药物等）所诱导的生殖系统损伤具有一定的保护和预防作用。

双酚A（bisphenol A，BPA）是许多塑料用品的常用原料，在日常使用中容易被人体摄入体内，容易引起睾丸组织的氧化应激而造成男性生殖功能的损伤。Khalaf等［20］研究发现，服用2 mg/kg 的纳米硒可通过减轻雄性小鼠睾丸组织的氧化应激来抑制BPA引起的生殖毒性，且效果明显优于同剂量的亚硒酸钠。

过度食用味精（monosodium glutamate，MSG）会可导致人体产生过量ROS、脂质过氧化水平过高，造成睾丸退化和精子数量、形态的改变，从而引起生殖毒性。Hamza 等［19］发现，无论是低剂量还是高剂量的MSG 均能在一定程度上造成雄性小鼠睾丸组织的损伤，而服用纳米硒能显著提高小鼠体内CAT、SOD 和GPx 等抗氧化酶的活性，降低睾丸组织的脂质过氧化水平，从而较好地改善和保护MSG 所诱导的雄性小鼠睾丸组织损伤。

溴氰菊酯（deltamethrin，DLM）是一类应用广泛的杀虫剂，但其在体内代谢会产生过量的ROS，对雄性小鼠生殖功能和精子的生成具有损害作用。服用0.5 mg/kg 的纳米硒可以提高小鼠GPx 等内源性抗氧化酶的活性，对DLM 诱导雄性小鼠的生殖毒性具有一定的保护潜力，这为提高男性的生殖能力提供了一种新的可能策略［21］。

纳米硒可以通过增强雄性动物睾丸组织的抗氧化能力，显著改善和预防因过量有毒化学物质在睾丸的蓄积而引起的氧化损伤，且毒性较低。

3.2 在消化系统疾病中的临床应用 氧化应激是引起消化系统损伤的重要原因之一。肝脏的氧化应激会引起ROS 的大量产生，导致肝细胞膜和基本细胞器的损伤，进而造成DNA 损伤，并通过细胞凋亡和坏死等途径引起肝细胞死亡［26］。作为人体主要的代谢器官，肝脏可将吸收的纳米硒代谢为有生物活性的有机形式，参与体内各种活性酶包括抗氧化酶系的生物合成［27］。因此，肝脏同样是纳米硒发挥抗氧化作用的重要靶标。

LESNICHAYA 等［27］报道，当给予肝损伤大鼠高剂量的由多糖硫酸酯κ-carrageenan（κCG）稳定的纳米硒时，能降低其血液中脂质过氧化产物的浓度，使肝酶水平正常化；当给予健康大鼠相同剂量时虽引起一定程度的脂质过氧化和泌尿系统的损伤，但未观察到死亡现象。证实纳米硒具有一定的肝损伤保护潜力，且生物相容性和安全性较高。

通过快速超滤法制备得到的纳米硒具有较好地清除DPPH、超氧阴离子和羟基自由基等的能力，并可通过延缓脂质过氧化，促进SOD、GPx、CAT 的活性以及改善硒保留等途径，保护小鼠免受concanavalin A诱导的自身免疫性肝炎［6］。

丙烯酰胺（acrylamide，ACR）容易在肝脏过量蓄积，引起肝毒性。HAMZA 等［26］采用纳米硒和维生素C 两大抗氧化剂的联合治疗策略，通过协同作用显著增强了雄性小鼠肝脏组织SOD、CAT、GR 等的表达水平，减少了肝脏组织脂质过氧化水平，对减轻ACR所诱导的肝毒性具有更为显著的效果。

纳米硒能够降低肝脏组织脂质过氧化水平，减轻氧化应激所诱导的肝损伤；而纳米硒和其他抗氧化剂的联合应用能增强保护效果。因此，纳米硒作为改善肝脏损伤的营养保护剂值得进一步发展和探索。

3.3 在神经系统疾病中的临床应用 大脑神经细胞由于存在氧气的消耗量高、易氧化底物含量高、抗氧化酶含量低、膜表面积与细胞质体积比值高等特点，容易受到ROS 引起的氧化损伤［28］。元素硒除了是大脑抗氧化防御系统的重要组成部分以外，还可以通过调节Ca2+通道、线粒体功能障碍等方式，改善大脑的氧化应激［29］。纳米硒通过多靶点作用，能够有效减轻大脑的氧化应激状态，延缓神经系统疾病的进一步病变和发展。

阿尔兹海默病（Alzheimer's disease，AD）作为一种复杂的进行性脑神经退行性疾病，氧化应激在其发病机制中起关键作用［29］。GAO 等［29］巧妙地将具有神经保护作用的硫酸软骨素和纳米硒相结合，制备了稳定的多靶点硒-软骨素纳米粒子（CS@Se）。该粒子一方面通过降低ROS 和MDA 水平，提高GPx表达水平，减少氧化应激引起的损伤；另一方面抑制了淀粉样-β 蛋白的聚集，减弱tao 蛋白的过度磷酸化，延缓了AD 的发展，为AD 的治疗提供了一种新的方法。

癫痫是一种特征为反复发作或无端发作的慢性神经退行性疾病。随着癫痫的发作，脑组织中会产生ROS 以及内源性抗氧化剂的失活。提前口服补充0.5 mg/kg 的纳米硒，可通过上调转录因子Nrf2和血红素加氧酶-1（HO-1）的表达，来减轻氧化应激，并同时抑制炎症反应和凋亡级联反应，延缓戊四唑注射后小鼠强直、肌肉痉挛和全面性癫痫发作的持续时间［1］。

缺血性脑卒中也是威胁人类健康的一类神经系统疾病。Amani等人设计了针对大脑毛细血管内皮细胞的单克隆抗体（OX26）-聚乙二醇化的纳米硒颗粒（OX26-PEG-SeNPs），在体内具有靶向缺血性脑卒中的能力［28］。

3.4 在糖尿病中的临床应用 糖尿病患者体内的持续高糖水平可导致机体氧化应激水平升高，而氧化应激直接参与糖尿病的发病机制及其并发症的发生［30］。对2 型糖尿病大鼠给予连续口服由聚乙烯基吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）修饰的硒纳米颗粒（PVP-SeNPs）0.5 mg/mL 一周，可缓解大鼠体内氧化损伤程度，提高调节糖异生和糖酵解过程中关键酶活性，提高胰腺和血浆胰岛素水平，有效地降低血糖，使受损的胰腺组织恢复［30］。

纳米硒具有一定的氧化应激改善能力，与降血糖药物的联合应用后能在有效降低血糖的同时，抑制氧化应激所致的组织损伤。Ebokaiwe 等［31］用纳米硒和二甲双胍联合治疗糖尿病小鼠的氧化性脑损伤和行为障碍，治疗后大鼠血糖水平降低，胰岛素分泌和胰岛β 细胞功能增强，抗氧化应激的关键核转录因子Nrf2的表达升高，细胞凋亡得到抑制。

由于对糖尿病和氧化损伤的双重治疗作用，纳米硒有望用于糖尿病的治疗和预防。同时纳米硒与降血糖药物的联用能显著增强对糖尿病及其并发症的治疗效果。

综上所述，大量制备纳米硒的方法已被开发，包括化学、物理和生物方法。但多数制备方法只适用于实验室小批量生产，且环境污染是一个值得关注的问题。摸索大批量绿色合成纳米硒的最佳工艺将成为未来研究纳米硒的一大重要方向。另外，对于纳米硒，修饰剂占据不可或缺的角色，如何选择和改进更为合理的修饰剂来进一步提高纳米硒的生物活性和靶向性也是今后可以继续深入的研究方向。

纳米硒主要通过直接清除活性氧簇、增强酶促抗氧化系统抗氧化能力及抑制细胞凋亡等机制发挥抗氧化作用。目前多数关于纳米硒抗氧化机制的研究集中在细胞凋亡，而对其他细胞死亡机制探究的相关文献报道却很少。由于其优异的抗氧化性能，纳米硒无论是作为单独或提前使用的补充剂，还是与其他药物进行联合应用，在各种氧化应激所致的组织、器官损伤以及一些相关疾病中均发挥较好的治疗和预防效果，但仍存在如应用的范围不够大、纳米硒与抗氧化剂等药物的联合应用不够深入等问题。