新型冠状病毒肺炎患者外周血淋巴细胞亚群计数动态观察

赵本南，刘大凤，杜清，陈红，刘亚玲，王玥莲，李青峰，张仁卿

成都市公共卫生临床医疗中心，四川成都610061

新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19；以下简称新冠肺炎）由一种新的冠状病毒引起，国际病毒分类学委员会对其进行基因组测序后命名为严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2）［1］。SARS-CoV-2 导致的新冠肺炎传染性强，人群易感，但患者普遍预后良好［2］。为加强新冠肺炎患者管理，《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》［3］建议新冠肺炎患者在出院后第2、4 周分别到定点医疗机构复诊。我们发现，与治愈出院时比较，普通型新冠肺炎患者治愈1 个月时外周血CD4+T 细 胞、CD8+T 细 胞 计数 没有 变化［4］。 感染SARS-CoV-2 是否会对患者细胞免疫功能造成长期的影响是目前研究热点，我们对39例康复期新冠肺炎患者外周血淋巴细胞亚群进行动态随访观察，旨在了解新冠肺炎患者治愈后的细胞免疫功能变化。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 截至2020年8月，选择在成都市公共卫生临床医疗中心治愈出院且在各研究时间点（治愈1、2、3个月）均到我院随访的新冠肺炎患者39例，年龄28～81 岁。依据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》［3］进行临床分型，其中轻型、普通型患者（轻症）26 例，重型、危重型患者（重症）13例。轻症新冠肺炎患者中，男11 例、女15 例，年龄（47.92± 12.79）岁，7 例（26.9%）伴有基础疾病，住院时间［13.0（8.0，20.2）］天；重症患者中，男9 例、女 4 例，年龄（56.15 ± 17.53）岁，5 例（38.5%）伴有基础疾病，住院时间［20.0（13.5，36.5）］天。重症患者住院时间长于轻症患者（Z=-2.241，P=0.025），两者年龄、性别比例、基础疾病占比等临床资料具有可比性。39 例患者均经严格隔离及有效治疗达到出院标准后出院。纳入标准：①国内感染患病者；②年龄≥16 岁者；③检查、资料齐全者。排除标准：①国外输入病例；②妊娠者；③伴有自身免疫性疾病或长期使用激素等免疫抑制药物者；④肿瘤患者。随机选取30 例我院感染科健康职工作为健康对照，其中男10 例、女20 例，年龄（40.17 ± 12.23）岁。本研究在中国临床试验注册中心的注册号为ChiCTR2000034563，经成都市公共卫生临床医疗中心伦理委员会批准（批件号：PJ-K2020-06-01），所有新冠肺炎复诊患者签署知情同意书，符合国家规定及《赫尔辛基宣言》的要求。

1.2 外周血淋巴细胞亚群检测 分别于入院时、出院时（治愈）及治愈1、2、3 个月（各时间点前后 ± 7 d）时，抽取患者外周静脉血2 mL，枸橼酸钠抗凝，采用贝克曼DXFLEX流式细胞计数仪及配套试剂盒检测淋巴细胞亚群［CD4+T、CD8+T、CD4+T/CD8+T、B（CD19+）细胞及NK（CD56+）细胞］，CD4+T计数正常值414～1 123/μL，CD8+T 计数正常值 238～874/μL。入院、出院结果取距离入院及出院当天最近的1 次检查结果。对照组收集2019 年体检时外周血T 淋巴细胞亚群结果。

1.3 统计学方法 应用SPSS 26.0 软件进行统计分析。正态分布的计量资料以表示，两组间比较采用两独立样本t检验；非正态分布的计量资料采用M（P25，P75）表示，两组间比较采用Mann-WhitneyU检验；轻症及重症新冠肺炎患者不同时间点测量的计量资料采用一般线性模型的Repeated Measures过程实现两因素重复测量资料的方差分析进行比较，并用Multivariate 过程实现不同分型患者在同一时间点的比较，同一分型患者在不同时间点的差异做配对t检验进行两两时间点精细比较；非正态分布的计量资料在进行重复测量资料的方差分析前经自然对数转换为正态分布的计量资料后再进行统计分析；计数资料以%表示，组间比较用Fisher 确切概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同时间点新冠肺炎患者外周血CD4+T、CD8+T 计数比较 轻症患者入院时外周血CD4+T、CD8+T 计数分别为［450.0（309.2，613.8）］、［253.5（180.8，363.2）］/μL；治愈出院时外周血 CD4+T、CD8+T 计数分别为［400.0（343.0，491.0）］、［299.0（205.0，357.0）］/μL；治愈1 个月时外周血CD4+T、CD8+T 计数分别为［418.0（316.0，484.5）］、［268.5（155.0，378.5）］/μL；治愈2 个月时外周血CD4+T、CD8+T 计数分别为［458.5（358.5，558.0）］、［336.0（281.8，409.0）］/μL；治愈3 个月时外周血CD4+T、CD8+T 计数分别为［562.5（456.0，703.2）］、［390.0（325.0，667.0）］/μL。与入院时、治愈出院时及治愈1 个月时比较，治愈2 个月时轻症患者外周血CD4+T 计数及 CD8+T 计数高（P均＜0.05）；与治愈 2个月时比较，治愈3 个月时轻症患者外周血CD4+T计数及CD8+T计数高（P均＜0.05）。

重症患者入院时外周血CD4+T、CD8+T计数分别为［189.0（135.5，365.0）］、［143.0（96.0，229.0）］/μL；治愈出院时外周血CD4+T、CD8+T 计数分别为［319.0（228.5，416.5）］、［236.0（151.5，373.5）］/μL；治愈1 个月时外周血CD4+T、CD8+T 计数分别为［334.0（235.0，589.5）］、［348.0（160.0，418.0）］/μL；治愈 2 个月时外周血 CD4+T、CD8+T 计数分别为［335.0（277.5，551.5）］、［324.0（197.5，515.5）］/μL；治愈 3 个月时外周血 CD4+T、CD8+T 计数分别为［559.0（326.5，669.5）］、［588.0（284.5，705.0）］/μL。重症患者入院时外周血CD4+T计数及CD8+T计数均较其它时间点低（P均＜0.05）；与入院时、治愈出院时、治愈1 个月时及治愈2 个月时比较，重症患者治愈3个月时外周血CD4+T计数、CD8+T计数高（P均＜0.05）。

与轻症患者比较，重症患者入院时外周血CD4+T 计数、CD8+T 计数低，治愈出院时外周血CD4+T 计数低（P均＜0.05），两者治愈1 个月时、治愈2 个月时、治愈3 个月时外周血CD4+T 计数及CD8+T计数的差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

2.2 不同时间点新冠肺炎患者外周血B 细胞及NK细胞计数比较 因多数患者入院时未查外周血B细胞及NK 细胞计数，故从治愈出院时作为第1个时间点统计比较。轻症患者出院时外周血B 细胞计数、NK 细胞计数分别为［98.0（49.0，143.0）］、［130.0（83.0，212.0）］/μL；治愈 1 个月时外周血B 细胞计数、NK 细胞计数分别为［103.0（70.0，139.5）］、［112.5（71.8，161.5）］/μL；治愈2 个月时外周血B细胞计数、NK 细胞计数分别为［119.0（87.2，159.0）］、［128.0（85.5，214.2）］/μL；治愈3 个月时外周血B 细胞计数、NK 细胞计数分别为［181.5（115.5，231.0）］、［175.0（108.2，310.2）］/μL。与入院时、治愈出院时、治愈1 个月时及治愈2 个月时比较，治愈3个月时轻症患者外周血B细胞计数、NK细胞计数升高（P均＜0.05）。

重症患者治愈出院时B 细胞计数、NK 细胞计数分 别 为［53.0（43.0，101.0）］、［135.0（120.0，176.5）］/μL；治愈 1 个月时外周血B 细胞计数、NK细胞计数分别为［82.0（58.5，121.5）］、［125.0（89.0，197.5）］/μL；治愈2 个月时外周血B 细胞计数、NK 细胞计数分别为［95.0（68.0，168.5）］、［175.0（109.0，218.5）］/μL；治愈3 个月时外周血B细胞计数、NK 细胞计数分别为［129.0（96.5，191.5）］、［240.0（139.5，336.0）］/μL。与入院时、治愈出院、治愈1 个月时及治愈2 个月时比较，治愈3 个月时重症患者外周血B 细胞计数、NK 细胞计数均高（P均＜0.05）。

轻症患者与重症患者在入院时、治愈出院时、治愈1个月时、治愈2个月时、治愈3个月时的外周血B细胞计数及NK 细胞计数比较，差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

2.3 新冠肺炎与健康对照者外周血CD4+T、CD8+T计数及CD4+T/CD8+T 比较 39 例患者入院时外周血CD4+T、CD8+T计数降低者分别为24、21例；治愈1个月时外周血CD4+T、CD8+T 计数降低分别为18、14例，治愈2 个月时外周血CD4+T、CD8+T 计数降低者分别为 15、9 例，治愈 3 个月时外周血 CD4+T、CD8+T计数降低者分别为4、3例。

健康对照者外周血CD4+T、CD8+T 计数分别为［634.0（488.8，861.3）］、［516.5（332.8，861.3）］/μL，CD4+T/CD8+T 为 1.35（0.90，1.85）。新冠肺炎患者入院时外周血CD4+T、CD8+T计数分别为［355.0（188.0，523.0）］、［216.0（120.0，324.0）］/μL；治愈出院时外周血CD4+T、CD8+T 计数分别为［390.0（316.5，480.0）］、［292.0（200.0，357.0）］/μL；治愈1 个月时外周血 CD4+T、CD8+T 计数分别为［403.0（259.0，486.0）］、［269.0（156.0，383.0）］/μL；治愈2 个月时外周血 CD4+T、CD8+T 计数分别为［440.0（335.0，552.0）］、［327.0（273.0，425.0）］/μL；治愈3 个月时外周血 CD4+T、CD8+T 计数分别为［559.0（451.0，685.0）］、［427.0（322.0，666.0）］/μL、CD4+T/CD8+T 为1.30（0.97，1.64）。与健康对照者比较，新冠肺炎患者入院时、治愈出院时、治愈1 个月、治愈2 个月时的CD4+T 计数及CD8+T 计数均低（P均＜0.05）。治愈3 个月时新冠肺炎患者CD4+T、CD8+T 计数及 CD4+T/CD8+T 对比健康对照者，P均＞0.05。治愈3 个月时新冠肺炎患者外周血CD4+T、CD8+T计数的几何均数分别为555、448/μL。

3 讨论

CD4+T细胞为主要的辅助性T细胞，能促进B细胞、细胞毒性T 淋巴细胞等免疫细胞的增殖、分化［5］；CD8+T 细胞可对毒性细胞发挥抑制作用［6］。研究显示，机体感染SARS-CoV-2后会触发细胞因子释放，推动T细胞的消耗和衰竭［7］，最终机体出现免疫系统紊乱［8］。本研究中，入院时分别有61.5%（24/39）、53.8%（21/39）的新冠肺炎患者伴有CD4+T 计数及CD8+T 计数低于正常下限，重症患者外周血CD4+T、CD8+T 计数低于轻症患者，提示新冠肺炎患者普遍存在CD4+T、CD8+T 数量减少，且在重症患者中下降更为明显，与王永等［9］、罗高权等［10］的研究结果一致。CD4+T 和/或CD8+T 计数降低可作为患者预后不良的独立危险因素［11-12］。本研究显示，治愈出院后1、2、3 个月时，轻症患者与重症患者的CD4+T、CD8+T计数比较，差异均无统计学意义。

NK细胞具有细胞毒效应，可以直接杀死被感染的细胞，并有助于适应性免疫应答的激活和定位［13］；B 细胞则在CD4+T 细胞的刺激下异化为浆细胞，进而产生特异性抗体。NK 细胞及B 细胞在机体感染病毒后控制病毒复制、清除病毒中起到重要作用。目前，临床上发现部分新冠肺炎患者出院后存在SARS-CoV-2核酸“复阳”现象，核酸“复阳”普遍发生在新冠肺炎患者治愈出院后的15 天内［14-16］，故有学者认为，患者在康复早期体内仍存在SARS-COV-2残留，病毒并未被完全清除，甚至可以间断复制［17］。这一观点解释了本研究中，与治愈出院时比较，新冠肺炎患者在治愈出院1 个月时，CD4+T 细胞、CD8+T细胞、B 细胞及NK 细胞计数均未升高，仍处于较低水平。治愈2 个月时，轻症患者外周血CD4+T、CD8+T 计数较前升高；治愈3 个月时，轻症及重症患者的外周血 CD4+T 细胞、CD8+T 细胞、B 细胞、NK 细胞计数均较前明显升高，且多数患者外周血CD4+T、CD8+T 计数已在正常范围。上述结果提示，随着治愈时间延长，新冠肺炎患者外周血淋巴细胞亚群数量可能会逐渐升高，免疫系统功能逐渐恢复。

新冠肺炎患者治愈3 个月时的CD4+T 计数、CD8+T 计数及CD4+T/CD8+T 与健康对照者比较，尚不能认为两者的CD4+T 及CD8+T 计数存在差异。但本研究中健康对照者例数偏少，能否真实反映四川地区总体水平未知，故与我国其他省市健康人群的外周血T 淋巴细胞亚群大数据比较可能更有意义。研究［18-20］显示，我国健康人外周血 CD4+T 细胞数量在不同性别、不同年龄间的差异无统计学意义，而CD8+T 细胞数量是否受性别及年龄影响结论不一。本研究中，新冠肺炎患者治愈3个月时外周血CD4+T计数的几何均数为555/μL，远低于湖北健康人群的681/μL［20］、上海健康人群的727/μL［19］及天津健康人群的860/μL［18］；CD8+T计数的几何均数为448/μL，低于上海健康人群的540/μL［19］及天津健康人群的672/μL［18］，但与湖北健康人群的 510/μL［20］接近。上述结果提示，治愈3 个月时新冠肺炎患者外周血CD8+T计数已接近正常水平，但CD4+T计数仍偏低。

目前，关于新冠肺炎患者治愈出院后的长期随访报道极少，考虑到SARS-CoV-2 与SARS 冠状病毒（SARS coronavirus，SARS-CoV）全基因组序列一致性达79.6%［21］，SARS患者在发病初期同样表现出细胞免疫功能受到明显损害、T 淋巴细胞计数减少［22-24］，康复期SARS 患者外周血淋巴细胞亚群的随访结果对评估新冠肺炎患者细胞免疫功能的远期变化具有一定的参考价值。谢静等［25］报道，SARS患者的CD4+T 细胞及CD8+T 细胞数量随着病情好转逐渐升高，与正常对照者比较，在发病后2～3 月时的CD8+T 细胞数量差异无统计学意义，但CD4+T 细胞数量仍低，且在发病1 年后CD4+T 细胞数量仍低于正常对照者。罗宏等［26］报道，部分SARS 患者在治愈出院2 年后，免疫功能仍存在损害，主要表现为CD3+T/CD8+T 值下降甚至倒置。因此，新冠肺炎患者细胞免疫功能逐渐恢复至正常可能需要经历一个长期过程。

综上所述，新冠肺炎患者在治愈早期，细胞免疫功能仍被抑制。随治愈时间延长，新冠肺炎患者外周血CD4+T、CD8+T、B 细胞及 NK 细胞数量可能会逐渐升高。与我国健康人群比较，治愈3 个月时新冠肺炎患者外周血CD8+T 计数已接近正常，但CD4+T计数仍偏低。从治愈出院1 个月起，新冠肺炎轻症患者与重症患者的CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞数量比较，差异均无统计学意义。本研究纳入样本量较小，观察时间截至治愈出院后3个月，需要在更大规模的患者人群中进行更长时间的观察验证本研究结果。