选择性COX-2抑制剂尼美舒利联合顺铂抑制肺癌细胞LRP及MDR1表达

吴 洁, 张 卿

(内蒙古医科大学附属医院呼吸内科,内蒙古呼和浩特010050)

在欧美国家,肺癌占常见肿瘤的首位并且仍以每年0.5%的速率增长。研究表明[1]约60%～80%的肺癌病人初次确诊时已到中晚期,已无手术机会,放化疗成为中晚期肺癌的主要治疗手段[2]。

大部分病人在发现肺癌时已失去手术治疗的最佳时机,因此放化疗在NSCLC中占有重要地位。但化疗的毒副作用导致病人生活质量差,耐受性差,化疗后期出现耐药等,是NSCLC化疗效果不理想的重要因素。我们的前期研究发现,选择性COX-2抑制剂NIM可诱导肺癌A549细胞凋亡、改变细胞周期分布、抑制细胞增殖;由此可能使肺癌综合治疗的疗效提高[3]。本实验探讨选择性COX-2抑制剂NIM与DDP联合应用对肺癌耐药细胞的逆转作用,并初步探究其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

细胞株:人肺癌耐顺铂细胞(A 549 DDP)株购自南京博尔迪生物科技有限公司。动物:BALB-C裸鼠:雄性,4～6wk,体重18～20g,购自中国医学科学院实验动物研究所

1.2 方法

培养A 549 DDP细胞株：RPMI-1640培养基中加入10%胎牛血清及100U/mL青霉素及链霉素双抗。PH调至7.2～7.4。在37℃,5%CO2孵育箱内培育。

A 549 DDP细胞裸鼠移植瘤模型的建立:将A 549 DDP细胞消化后,用不含血清的1640培养基洗涤2次,最后用PBS液制成细胞数为5.0×106/0.2mL的细胞悬液,于裸鼠左前肢背侧皮下注射0.2mL。成功构建A 549 DDP细胞荷瘤鼠模型:接种A 549 DDP细胞3d左右开始成瘤,成瘤率达100%。移植瘤形态有圆形、卵圆形及结节型,瘤体早期平滑,体积逐渐增大后,后期部分瘤体出现破溃及结痂。成瘤期间裸鼠无其它明显不良反应,饮食及活动正常,活力尚可,生长状态良好。

实验分组及药物干预治疗:将裸鼠完全随机分为对照组、DDP组、NIM组、NIM联合DDP组,每组8只。称量裸鼠体重,按裸鼠公斤体重计算各组各药使用剂量,自细胞接种后第3d开始,对照组每只每天以0.5%CMC0.2mL灌胃21d,0.9%生理盐水0.2mL/4d腹腔注射;NIM组给予NIM 6 mg/mL连续灌胃21d;DDP组给予DDP(0.5g/mL)0.2mL/4d腹腔注射;联合组给予NIM 6 mg/mL连续灌胃21d,顺铂(0.5g/mL)0.2mL/4d腹腔注射;饲养期间观察裸鼠精神、活力、饮食及排便等一般情况。

绘制肿瘤生长曲线及计算肿瘤抑制率:连续21d药物干预,每3d使用电子称称量荷瘤裸鼠体重1次、使用游标卡尺量各组肿瘤长短径1次,绘制移植瘤生长曲线,移植瘤近似体积按公式:V=ab2/2估算[4](a,b分别为移植瘤的最长径、最短径)。药物干预21d后再次称裸鼠体重并断颈处死动物,剥离皮下A 549 DDP细胞移植瘤,称瘤重,计算移植瘤体积抑制率及移植瘤重量抑制率:移植瘤体积抑制率=(对照组移植瘤体积-实验组移植瘤体积)/对照组移植瘤体积×100%;移植瘤重量抑制率=(对照组移植瘤重-实验组移植瘤重)/对照组移植瘤重×100%

由北京d根生物技术研究提供的总RNA提取试剂盒(离心柱型)RNA simple Total RNA Kit 提取移植瘤组织总RNA。采用Thermo Fermenta K1622反转录试剂盒进行反转录。选取GAPDH为内参基因,GAPHD和目标基因引物的设计和合成均委托invitrogen生物技术公司设计并合成。设计引物:MDR1、LRP、 GAPDH进行实时荧光定量。

1.3 统计学分析

采用SPSS18.0软件系统分析所得数据,结果分析根据是否符合正态分布;具有方差齐性采用单因素方差分析比较多组间均数的差异,方差不齐时采用秩和检验,P<0.05为差异有统计学意义。检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 尼美舒利对裸鼠移植瘤生长的影响

肿瘤生长曲线及肿瘤抑制率:绘制肿瘤生长曲线(见图1)。除第3d外,联合组、NIM组、DDP组裸鼠移植瘤体积均显著低于对照组,生长速度明显缓慢于对照组(P<0.05),差异有统计学意义。SNK-q检验两两比较后联合组、NIM组、DDP组的体积抑瘤抑制率分别为:72.93%、56.84%、31.35%。重量抑瘤率分别为53.41%、41.86%、21.89%;联合组移植瘤体积显著低于对照组及NIM组(P<0.05);对照组瘤体积显著高于联合组、NIM组、DDP组(P<0.05)(见表1)。

表1 对照组、NIM组、DDP组、联合组瘤质量及体积

2.2 荧光定量RT-PCR结果统计分析

对照组、NIM组、顺铂组、联合组LRP mRNA、MDR 1 mRNA在各组移植瘤的表达;经单因素方差分析后对照组、NIM组、DDP组、联合组的LRP及MDR1基因表达量得出的F值分别为:25.377(P<0.01)、17.309(P<0.01)证明四组之间表达量有显著差异。经过SNK-q检验后进行两两比较,显示DDP组中LRP mRNA、MDR 1 mRNA表达量均高于对照组、NIM组、联合组,差异有统计学意义(P<0.01);联合组(NIM+DDP)LRP mRNA、MDR 1 mRNA表达量明显低于其他各组差异有统计学意义(P<0.01);NIM组LRP mRNA、MDR 1 mRNA表达均低于对照组及DDP组。差异有统计学意义。

3 讨论

近年来,肿瘤的发生率逐步上升,尤其肺癌在全世界的总发病率呈现急剧上升的趋势,高居恶性肿瘤榜首[5]。目前肺癌的治疗方法主要为手术及放化疗联合,导致化疗失败的主要原因是肿瘤细胞对化疗药物表现出来的耐药性,这已成为治疗肿瘤的一大障碍。

肺癌化疗的多药耐药是一个多基因、多因素的过程,主要有MDR1、LRP、P-gP、ToPo-II、GST-π等参与耐药机制的形成[6]。这些因子通过不同的机制介导肺癌细胞对化疗药物产生抵抗。李宁等[7]研究显示,MDR 1 mRNA的蛋白产物P-gP能通过将药物泵出胞外使得肿瘤细胞内的药物浓度降低而提高细胞的耐药性。另有研究显示[8]LRP mRNA表达的增加可导致化疗药物的耐药,其中对顺铂耐药的影响尤为明显。

我们的前期研究发现,选择性COX-2抑制剂NIM可诱导肺癌A549细胞凋亡、改变细胞周期分布、抑制细胞增殖的作用,本研究将A 549 DDP细胞培养、传代后配制细胞悬液,接种于裸鼠皮下,并成功构建A 549 DDP细胞裸鼠皮下移植瘤模型。体内试验表明: NIM组、DDP组、联合组移植瘤生长迟缓,体积显著小于对照组(P<0.05)。抑瘤率联合组72.93%与其他组相比显著增高(P<0.05)。提示联合组对移植瘤生长有明显抑制作用,联合组较其他组别LRP、MDR1表达量明显下调。顺铂组作用移植瘤后,其表达量更强。由此推断应用NIM后耐药细胞对DDP敏感性提高,尼美舒利可能对DDP化疗耐药起到了逆转作用。

我们的研究结果显示,选择性COX-2抑制剂NIM联合DDP可抑制A 549 DDP移植瘤生长的作用以及逆转A 549 DDP对顺铂耐药的作用。其机制可能与下调LRP、MDR1的表达有关。为肺癌的综合治疗提供了新的治疗策略。