宫颈癌进展的生物信息学研究 *

毛建英, 袁海涵

(1.内蒙古自治区人民医院妇产科,内蒙古呼和浩特010017; 2.北京市大兴区人民医院)

作为中国女性第二常见的癌症类型,近年来宫颈癌的发病率有上升趋势,15～44岁女性癌症病人中,宫颈癌发病率居第二位,而死亡率居第三位[1],提升宫颈癌的诊断、筛查可有效得防治宫颈癌。

本研究从美国国立生物技术信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)下载了宫颈癌进展相关数据集,利用生物信息学分析进一步挖掘了宫颈癌进展过程中的基因表达图谱及信号通路等,以期为临床宫颈癌的快速诊断和精准治疗提供潜在生物标记物。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

本研究收集的宫颈癌进展芯片数据来源于NCBI数据库中的GEO数据库,该套芯片数据是由Espinosa AM提交的GSE39001芯片数据,该套芯片数据研究所采用的实验平台是Affymetrix公司的HT HG-U133+ PM Array Plate,它共含有43例宫颈癌组织样本及12例对应的癌旁组织样本[2]。

1.2 实验方法

1.2.1宫颈癌组织芯片数据处理 利用GEO数据库中自带的GEO2R(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/GEO2R/)对GSE103512芯片数据进行标准化处理,深度挖掘差异表达基因(different expression genes,DEGs)。

根据组织芯片中不同组织的来源,将芯片中的组织分为宫颈癌旁组织(adjacent tissues,A)及宫颈癌组织(cancer tissues,C),进一步进行数据分组,采用T检验对两组数据进行比较,筛选该套组织芯片的差异表达基因,筛选条件是P<0.01,|Fold change|≥1.0。

1.2.2宫颈癌进展差异表达基因GO分析及信号通路分析 将宫颈癌进展相关差异表达基因上传至DAVID数据库中,进行基因名称转换。选择该数据库中的基因功能注释模块(functional annotation),分别对纳入的差异表达基因进行生物学过程(biological process)、分子功能(molecular function)、细胞组成(cellular compotent)及生物学信号通路(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)的GO分析,筛选宫颈癌进展过程中差异表达基因富集的生物学过程、分子功能、细胞组成(筛选标准均为P<0.05);并进一步对差异基因富集的相关信号通路进行筛选、校正(P<0.05)[3,4]。

1.2.3宫颈癌进展的蛋白质相互作用网络 将宫颈癌进展的相关差异表达基因进一步导入STRING数据库中,分析蛋白质之间的相关性,进一步利用数据库绘制、分析蛋白质相互作用网络(protein protein interaction network,PPI),在此基础上,进一步根据生物信息学学的标准流程,通过Cytoscape软件(https:∥cytoscape.org/)分析、筛选与宫颈癌进展相关的核心基因(hub genes,筛选标准:满足Degree≥10)[5,6]。

1.2.4宫颈癌进展过程中核心基因表达水平分析 利用GEPIA数据库中的Gene correction模块(基因相关性),在宫颈癌(cervical invasive carcinoma)模型下,分析、比对上述核心基因在宫颈癌组织及正常宫颈组织中的表达水平[7]。

1.2.5数据分析 在本部分研究中,采用SPSS19.0软件包进行实验数据的处理分析,数值用平均值±方差的方式进行表示,采用单因素方差LSD检验比对、分析组间数据;P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 DEG筛选

从GSE39001数据集中鉴定出共112个DEG,与正常宫颈组织相比,宫颈癌进展过程中存在42个上调基因(如APOBEC3B,AURKA,BUB1B)和70个下调基因(如ABCA8,ACTG1P4,ADRA2A)。

2.2 宫颈癌进展的GO分析

宫颈癌进展的GO分析结果,生物过程组中,DEG主要富集于细胞增殖过程的正向调控、细胞凋亡过程的负向调控及细胞分离等过程(见表1);分子功能组中,主要富含肝素结合等;在细胞成分中,主要富集于蛋白质类细胞外基质。KEGG信号通路富集结果显示,主要富集于调控细胞周期的调控及P53信号通路(见表2)。

2.3 宫颈癌进展PPI分析

宫颈癌进展过程中的核心基因分别为RFC4、TOP2A、PCNA、BUB1、TPX2和KIF20A,上述核心基因编码蛋白PPI结果示(见图1)。

2.4 核心基因与宫颈癌进展相关性分析

宫颈癌及其对应宫颈正常组织中核心基因的表达水平结果示,在宫颈癌组织中,RFC4、BUB1、TOP2A、PCNA、TPX2和KIF20A基因的表达水平均显著高于对应的正常宫颈组织。

3 讨论

宫颈癌的体内发展过程比较复杂,然而由于目前大多数的研究均来源于单个队列研究,对病人的预后并不理想,为了进一步挖掘宫颈癌进展过程,本论文通过生物信息学的方法,筛选出了6个核心基因RFC4、TOP2A、PCNA、BUB1、TPX2及KIF20A。GO结果表明宫颈癌进展过程中的DEGs主要参与调控细胞分裂、DNA复制、细胞周期和转录等调控过程。

作为RFC家族成员之一,RFC4密切参与调控真核细胞DNA复制以及DNA损伤修复等过程,而且该基因的活性与如细胞周期中S期检查点的调节及姐妹染色单体凝聚和基因组维护密切相关,其表达水平的异常与癌症进展密切相关,而且目前已有研究报道指出对于早期宫颈癌病人,RFC4表达水平与宫颈癌进展密切相关[8]。

作为DNA合成转录、染色体分离等过程的关键调控基因,TOP2A,常用作化疗药物疗效评估预测因子,其肿瘤组织中的表达水平可显著调控肿瘤细胞对蒽环类肿瘤靶向药物的反应性[9],PCNA,即增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen),是哺乳动物细胞有丝分裂过程的关键调控蛋白,该蛋白仅在增殖的细胞中表达,其表达水平的异常增加可以显著性地促进体内肿瘤细胞的失控增殖,进一步促进癌症进展。

表1 宫颈癌进展过程GO分析结果

表2 宫颈癌进展过程KEGG信号通路分析

BUB1,位于人染色体2q14,该基因由25个外显子构成,其编码的BUB1蛋白则由1085个氨基酸残基构成;该蛋白结构域中包括一个保守的、可以与动粒结合的N-末端结构域,中间为BUB3结合所必需的非保守结构域,而其C-末端结构域具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性[10,11]。BUB1蛋白的活性与纺锤体检查点活性密切相关,其表达水平的异常会导致细胞内染色体不稳定性的产生,进一步促进肿瘤的发生、发展、转移,与癌症病人的预后情况密切相关[12～15]。

TPX2基因,又称Repp86,定位于人类染色体20q11.2,,作为受细胞周期严格调控的核增殖相关蛋白及微管相关蛋白,TPX2蛋白主要功能为在维持纺锤体稳定性并调控细胞周期及有丝分裂过程,并与肿瘤的分化、侵润和复发关系密切相关。

综上所述,本部分研究利用生物信息学的方法,结合组织芯片数据,利用一系列网络数据库分析了宫颈癌进展相关的差异表达基因图谱,并深入地分析了差异表达基于富集的癌症进展调控过程及其关键信号通路,并在此基础上,利用癌症进展相关数据库验证了宫颈癌进展过程相关核心基因表达水平与宫颈癌进展过程的相关性,为下一步临床、细胞模型探索宫颈癌进展的相关性指明了研究方向。