高效液相色谱-质谱法测定大青叶中靛蓝和靛玉红的含量 *

王巍嵩, 朱贲贲, 徐智宇

(1.内蒙古医科大学附属医院,内蒙古呼和浩特010050; 2.内蒙古医科大学附属人民医院)

大青叶为十字花科植物松蓝(IsatisindigoticaFort.)的干燥叶。性苦,寒。具有清热解毒,凉血消斑。用于温病高热,神昏,发斑发疹,痄腮,喉痹,丹毒,痈肿[1]。主要产于内蒙古、陕西、甘肃、河北、山东、江苏、浙江、安徽、贵州等地。现行药典只规定了使用高效液相色谱法测定大青叶中靛玉红的含量,其提取分离耗时费力,不利于大规模批量检验,而且也不能完全反应药材的质量。本研究使用高效液相色谱-质谱法测定大青叶中的靛蓝和靛玉红,能较好的反应大青叶的质量,前处理简便易行,适用于大批量检测。

1 仪器与试药

1.1 仪器

赛默飞世尔 TSQ Ultra EMR 型三重四极杆高效液相色谱-质谱联用仪(包括UltiMate3000高效液相色谱仪);昆山市超声仪器有限公司 KQ 5200 DE 型超声波清洗器;梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司 XS 205 DU 型电子天平(d =0.01mg)。

1.2 试药

靛蓝对照品(批号110716-201612,含量为98.7%)、靛玉红对照品(批号:110717-201805,含量为99.6%),均购自于中国食品药品检定研究院;甲酸和异丙醇均为分析纯;乙酸乙酯和甲醇为色谱纯;水为自制超纯水,符合 GB/T6682～2008分析实验室用水国家标准。

1.3 实验用大青叶

自采于内蒙古呼和浩特市大青山地区,干燥后经包头市食品药品检验检测中心菅艳艳主任中药师鉴定其为十字花科植物松蓝,即药材大青叶。

2 实验方法

2.1 提取与净化

精密称取研成粉末的大青叶约1g(精确到0.001g)置于100mL量瓶中,加入80mL乙酸乙酯,涡旋振荡约5min,超声处理约30min(功率300W、频率50Hz),冷却到室温,加乙酸乙酯到刻度,摇匀,待用。

2.2 色谱条件

色谱柱:赛默飞世尔 Accucore C18色谱柱(100mm×2.1mm,2.6μm);流动相:5mmol/L甲酸 溶液-甲醇(80∶20,v/v)。流速:0.2mL·min-1。柱温:20℃。进样量:5μL。

2.3 质谱条件

离子源:电喷雾离子源(ESI 源)。监测模式:正离子监测模式。离子源电压(IS):3300V。碰撞气 (CAD)、气帘气(CUR)、雾化气(GS1)、辅助气2(GS2)均为高纯氮气,纯度为99.995%。其中气帘气 (CUR)172.37KPa(25psi),雾化气(GS1)379.21kPa(55psi),辅助加热气(GS2)413.70KPa(60psi),碰撞气(CAD)Medium。电喷雾电压(IS)5000V,离子源温度(TEM)500℃,采集时间100ms。

分别以正电离模式的 [M + H]+和负电离模式 的 [M - H]-对靛蓝和靛玉红进行 Q1分子 离子全扫描。结果表明,靛蓝和靛玉红在正电离模式下有很高的响应,其母离子(m/z)均为263.261,去簇电压(DP)为28V;子离子(m/z)为235.12和219.07;碰撞能量(CE)分别为14V 和11V。由于235.12的碎片离子较稳定,故均选择其作为定量离子。靛蓝的保留时间为5.53min,靛玉红的保留时间为5.62min。

2.4 方法学考察

2.4.1线性关系考察 精密称取适量靛蓝和靛玉红对照品,分别置于10mL量瓶中加乙酸乙酯适量,摇匀,再加入乙酸乙酯至刻度,制成靛蓝和靛玉红的储备液。临用前吸取适量储备液制成靛蓝和靛玉红的浓度分别约为10、50、100、500、1000、5000ng·mL-1的系列浓度对照品溶液。按2.2项下方法测定分析,以靛蓝和靛玉红的峰面积对其浓度进行线性回归,得到靛蓝的线性方程为 y=19596x+790826,R2=0.9992,靛玉红的线性方程为y=45600x+1709471,R2=0.9991。靛蓝和靛玉红在10～5000ng·mL-1内与峰面积均呈良好的线性关系。

2.4.2精密度实验 精密吸取同一供试品溶液5μL,重复测定6次,得到靛蓝和靛玉红的峰面积,结果RSD值分别为0.7%(n=6)和1.0%(n=6),表明本方法的精密度良好。

2.4.3重现性实验 取同一样品5份,分别制备供试溶液,得到峰面积并计算含量,结果供试品中靛蓝含量 RSD 值为1.3%,靛玉红含量的 RSD 值为1.1%,表明本方法重复性良好。

2.4.4加样回收实验 精密称取已知含量的大青叶置于100mL容量瓶中,分别加入含有靛蓝7.326μg(含量为98.7%)和靛玉红26.634μg(含量99.6%)的对照品溶液,按2.2项下进行定量分析,结果如表1所示。

2.5 测定结果

根据“2.2”项下方法测定同一批大青叶样品中靛蓝和靛玉红的含量,测定结果分别为0.06825g/100g 和0.2793g/100g,表明此方法准确可靠,适合在实践中应用。

表1 加样回收实验(n=6)

3 讨论

大青叶作为一种常见的中药材,在成方制剂中也有大量的应用。本品中含有靛蓝、靛玉红、 青黛酮[2],腺苷[2]、丁香酸[3],烟酸[4]和亚油酸[5]等多种化合物,具有抗菌[6],抗病毒[7]、抗癌[8]和免疫调节作用[9]等。其质量优劣和有效成分含量直接决定了其药理作用及药物效价,因此对其化学成分含量的准确测定可为评价不同质量的大青叶提供衡量标准。

本研究建立了大青叶中靛蓝和靛玉红的HPLC-MS/MS 测定方法,该法重现性良好,操作简便、 结果准确,且较高效液相色谱法样品用量小。运用本方法对大青叶中的靛蓝和靛玉红进行检测,能够为大青叶的分类评级提供科学的依据,也可为其他药品中靛蓝和靛玉红的含量测定提供参考依据。