纳米孔道单分子电化学测量仪器的稳定性研究

陈婷婷，应佚伦，崔凌飞，钟诚兵，胡正利，顾 震，龙亿涛*

(1.华东理工大学 化学与分子工程学院，上海 200237；2.南京大学 化学化工学院，生命分析化学国家 重点实验室，江苏 南京 210023)

单个生物分子是影响和调控生命功能的基本单元之一，理解和研究单个生物分子可解析微观尺寸下生命活动的基本特性[1-5]。现有单分子检测方法主要为原子力显微镜[6]、单分子荧光检测技术[7]、扫描隧道显微镜[8]等。基于这些方法，可以实现在单分子水平上对核酸(如DNA、RNA)及蛋白质等生物大分子及其相互作用的检测和分析。纳米孔道分析技术作为一种基于纳米孔道限域效应的单分子测量技术[9-12]，具有通量高、尺寸小、无需标记、无需真空环境、灵敏度高及成本低等优点，已被用于DNA分析[13-16]、RNA检测[17-18]、蛋白质识别[19-20]及单分子反应研究等[21-24]。如利用野生型的Aerolysin纳米孔道，不仅可以分辨长度为2到10个碱基的单个核苷酸，还可用于实时监测核酸外切酶Ⅰ逐步裂解核酸的过程[25-26]。利用α-溶血素(α-Hemolysin,α-HL)纳米孔道可检测不同长度的类胶原肽以及区分其构型，以进一步实现混合体系中3种分析物的同时检测[20]。纳米孔道获取纳米尺度信息是基于对皮安级微弱电流和毫秒级时间分辨实现的。这种微弱电流信号的放大、快速获取和高效储存对纳米孔道检测仪器提出了巨大的挑战：首先，仪器装置需要极高的电流分辨(皮安级)[27]和极高的带宽(>5 kHz)[28]，用于保证单分子信号测量的灵敏度和可靠性；其次，测量仪器需要稳定性好、信噪比高，以及可在常规实验室进行单分子检测操作；再者，样品现场测量需要检测设备体积小、便携且对检测环境无特殊要求。然而，现有的商品化电化学仪器均难以同时满足以上3点。尤其是，仪器带宽的提高往往意味着测量噪音的增加，而仪器体积较大不易于满足现场纳米孔道实验的需求，且对防震台、接地系统等条件的需求降低了纳米孔道仪器装置的普适性。因而，亟需一种新型的单分子检测手段和通用型超灵敏仪器设备。

本课题组研制的Cube系列纳米孔道仪器具有低噪音测量、集成化设计、高时间分辨率、高电流分辨的特点[29]，可实现对单个分子在纳米孔道内产生的微弱阻断信号进行高通量、高带宽的实时采集，且仪器体积小巧，便于携带，适合多种检测环境[28,30]。Cube系列纳米孔道仪器的特点具体如下：(1)设计电阻反馈式的前置放大器电路，将微弱电流信号放大再转换成较大的电压信号，并传输到后续电路进行处理，避免微弱信号被噪声覆盖；(2)引入频率补偿电路，消除寄生电容和输入电容对信号带宽产生的影响，提高仪器的时间分辨和电流分辨能力；(3)采用电池对前置放大器单独供电，设计电压调理电路，降低电源噪音和电压波动产生的干扰，使仪器可在普通实验室使用；(4)设计基于现场可编程逻辑门阵列(Field programmable gate array,FPGA)的高速数据采集电路，利用软件改变芯片内部逻辑门的连接方式和逻辑运算方法，达到实现定制信号处理的功能，实现高速同步的数据采集；(5)整体仪器采用高度集成化设计，使其整体尺寸小于12 cm，以实现测量屏蔽系统及仪器的便携化。

为了验证Cube系列纳米孔道仪器的稳定性和灵敏性，本文选择气单胞菌溶素(Aerolysin)生物纳米孔道作为测量所用纳米孔道。相比于较常用的α-HL[31]、耻垢分枝杆菌蛋白A(Mycobacterium smegmatis porin A,MspA)孔道[32]，Aerolysin具有孔径窄，且孔道内含大量带电氨基酸等优势，使其在生物分子分析中具有极高的灵敏性、空间分辨率以及构型稳定性，从而被广泛地应用于小分子核酸、多肽的检测分析[33]。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

氯化钾(≥99.5%)、正癸烷(无水，≥99%)、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(0.25%)均购于美国Sigma-Aldrich公司；盐酸(36.0%～38.0%)、乙二胺四乙酸(99.995%)、磷酸钠(≥98%)、三羟甲基氨基甲烷(Tris，≥99.9%)均购于上海阿拉丁试剂公司；1,2-二植烷酰基磷脂(200 mg)购于美国Avanti Polar Lipid Inc.公司，储存条件为-20 ℃；野生型Aerolysin用Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)配置成质量浓度为10 μg/mL蛋白溶液，存于-20 ℃冰箱备用；实验所用待测Poly(dA)4的序列为5’-AAAA-3’，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并通过高效液相色谱提纯，储存条件为-20 ℃；实验用水均为由Milli-Q纯水仪(美国Millipore公司)制备得到电阻 率为18 MΩ·cm(25 ℃)的超纯水。

Bilayer perfusion chamber(BCH-P)检测池(美国Warner Instruments公司)，由cis和trans两腔室组成，两个腔室的容积均为1 mL，其中trans腔室中央弧形区域中有1个直径为50 μm的孔用于构建磷脂双分子层以及蛋白纳米孔道；实验所采用的Ag/AgCl电极通过电镀法制得，银丝直径为1.0 mm，购于英国Alfa Aesar公司；ClampFit 10.3数据处理软件(美国Molecular Devices公司)；Nanopore Analysis数据处理软件(实验室自主开发，下载网址为https://hysz.nju.edu.cn/ytlong/65/2a/c36917a484650/page.htm)；Origin 9.0(美国OriginLab Corporation 公司)；Cube系列超低电流纳米孔道分析仪(Cube-01，实验室自主开发)；高阻值电阻(1 GΩ)；膜片钳仪器系统(美国Molecular Devices公司)，包含电流放大器Axonpatch 200B和数模转换器Digidata 1440A。

1.2 实验方法

1.2.1 1 GΩ电阻测量Cube纳米孔道仪器分为信号处理主机和前置电流放大器两部分(图1A)，其尺寸分别为12 cm×12 cm×8 cm及7.5 cm×5.5 cm×12.6 cm。其中前置电流放大器设计有电池槽、前置探头、电极连接件、纳米通道检测池及屏蔽箱，高集成化屏蔽箱的存在可极大的消除外部电磁噪音干扰。

将电池放入电池槽，将1 GΩ电阻用鳄鱼夹与两电极相连后，通过连接线将探头与电池槽相连，用USB数据线将主机与电脑相连，主机指示灯亮，用音频线将主机与探头相连(图1A)，打开探头开关，探头指示灯亮。

图1 Cube纳米孔道仪器(A)及软件运行界面截图(B)Fig.1 Cube ultrasensitive nanopore instrument (A) and software operation interface screenshot(B)

启动实验室设计的Smart Nanopore软件，图1B为软件界面截图，具体操作步骤如下：(1)从左向右依次点两个连接开关(图1B-①)，符号由灰变绿则表示连接成功，否则需要检查连接问题；(2)连接成功后根据所连的仪器标识参数进行数据采样设置(图1B-②)；(3)设置结束后点击Start按钮，软件开始运行,图1B-⑥电流显示界面、1B-⑧电压显示界面分别出现相应的电流、电压曲线；(4)通过图1B-③处进行电压施加设置，分别通过图1B中的⑤、⑦、⑨调节电流显示、电压显示、时间尺度；(5)点击图1B-④处“Conf.”按钮设置数据存储路径以及文件名，点击“Rec.”按钮开始或停止记录。

以上步骤均完成后，开始记录1 GΩ电阻的测量信息。在5 kHz滤波下，施加电压由0 mV变至200 mV，再由0 mV变至-200 mV，每次变化值Δ=10 mV，时间间隔5 s，记录电流随电压的变化曲线。一般为了表征纳米孔道的电化学性质，可绘制其不同电压下的电流响应曲线，即I～V曲线[32]。因此，这里对1 GΩ电阻用相同的方法表征，同时记录下电流噪音均方根(RMS)值，并计算一个周期内电流噪音信号最高值和最低值之间的差值，即电流噪音峰-峰(Peak-Peak)值。分别将滤波变为10、100 kHz，重复以上步骤。

1.2.2 纳米孔道实验组装cis和trans腔室成检测池，在两端分别注入1 mL Tris-KCl溶液，并置入Ag/AgCl电极，打开开关，施加电压调至100 mV。将磷脂溶液均匀涂抹在检测池的微孔处，形成磷脂双分子层，根据击破电压调节至合适的膜厚。在200 mV电压下，在cis端近微孔处小心快速注入0.5～2.0 μL的Aerolysin蛋白溶液，待自组装形成单个纳米孔道后，记录5、10、100 kHz 3个滤波下的I～V曲线、RMS值。在10 kHz滤波、20 mV电压下，在cis端缓慢注入20 μL Poly(dA)4溶液，使其终浓度为2 μmol/L，分别记录100、120、140、160、180 mV下的纳米孔道单分子阻断电流变化。

以上实验均在温度(22.0±0.5) ℃，湿度45%±5%条件下进行。

2 结果与讨论

2.1 仪器稳定性测试

纳米孔道单分子电化学测量仪器的稳定性评估主要考虑环境噪音干扰，例如不同时刻外界震动、温度、湿度、电磁场等变化造成的纳米孔道实验噪音干扰等。为了验证纳米孔道仪器的稳定性，本研究首先通过在Cube纳米孔道仪器的电极端接入1 GΩ电阻进行噪音评估，即测量并比较不同时间内、不同截止频率下仪器的RMS及Peak-Peak水平。

电压通过双电极体系施加在电阻两侧，其中一侧为工作电极，另一侧接地，工作电极通过放大器系统改变施加电压；同时，电流通过工作电极接入放大器系统，并经过前置放大、信号调理和模数转换采集到计算机(图2A)。纳米孔道仪器的贝塞尔低通滤波电路可对输入信号进行降噪处理，如图2B所示，在施加电压为0 mV的条件下，改变仪器的截止频率，随着截止频率的增加(5、10、100 kHz)，Peak-Peak值、RMS值也随之增加，与文献报道相一致[25]。

图2 使用电阻验证Cube纳米孔道仪器的稳定性。仪器系统设计方案(A)；在不同截止频率、0 mV电压下， 电阻的基线电流(B)、Peak-Peak值(C)、RMS值(D)；以5 kHz截止频率为例，5天稳定性测试的I～V 曲线(E)；不同截止频率下，5天内测得的电阻的电导(F)Fig.2 Stability test of the Cube ultrasensitive nanopore instrument verified using a resistor.Instrument system design(A); Baseline current(B),Peak-Peak value(C),RMS value(D) of the resistor at different cut-off frequencies under the potential of 0 mV;I-V curve(5-days stability test,taking 5 kHz as an example)(E);Conductance values of the resistance at different cut-off frequencies in 5 days(F)

连续5天进行重复实验，获得在5、10、100 kHz 3种截止频率下(施加电压为0 mV)的Peak-Peak值分别为(1.70±0.12)、(2.14±0.17)、(69.20±20.08) pA；电流基线的RMS值分别为0.2±0.0、0.3±0.0、9.4±2.3(图2C-D)。在商品化仪器中进行相同重复实验，Peak-Peak值分别为(3.87±0.12)、(7.83±0.29)、(90.00±5.00) pA；RMS值分别为(1.0±0.2)、(2.4±0.5)、(18.1±3.3) pA。对比发现，在5、10、100 kHz条件下，Cube纳米孔道仪器获取的电流基线的RMS值分别比商品化仪器减少了80.0%、87.5%、48.2%，RMS值测量误差波动也远小于该商品化仪器，这说明Cube纳米孔道仪器的控制噪音能力更强，测量稳定性更好。为了进一步说明Cube纳米孔道仪器在不同电压下的稳定性，在5 kHz滤波下，获取连续5天的I～V曲线(如图2E)，并分别在5、10、100 kHz 3种截止频率条件下进行5天稳定性测试(如图2F)，计算得到电导分别为(1.00±0.0 1)、(1.00±0.01)、(1.00±0.01) nS，测量误差均小于1.0%，结果表明仪器运行稳定，不随环境时间和施加电压的变化而产生强烈的电流测量波动。

2.2 Aerolysin纳米孔道检测Poly(dA)4

以检测Poly(dA)4为例，验证了Cube纳米孔道仪器在纳米孔道检测过程中的运行情况(如图3A所示)。图3B表示在0 mV施加电压下5、10、100 kHz滤波的电流基线，并计算得到Peak-Peak值分别为(2.88±0.11)、(4.01±0.62)、(300.90±63.20) pA；RMS值分别为(0.4±0.1)、(0.5±0.1)、(30.0±4.6) pA。为进一步说明Cube纳米孔道仪器在纳米孔道检测过程中的稳定性，分别在5、10、100 kHz 3种截止频率下进行5天纳米孔道的稳定性测试，其中在5 kHz滤波下得到I～V曲线如图3C，分别计算得到电导为(0.53±0.01)、(0.53±0.01)、(0.53±0.01) nS(如图3D)，测量误差均小于2.4%，结果表明仪器测量基本稳定。选取3天不同的施加电压值(0～180 mV，ΔV=10 mV)，计算施加电压值的实际值和标准偏差，由不同的实际电压的标准偏差计算得到仪器的标准偏差为0.014 mV，占施加电压变化量(10 mV)的0.14%，表明该仪器的误差较小，可用于超灵敏的电化学测量实验。

图3 Aerolysin纳米孔道检测Poly(dA)4的示意图(A);不同截止频率下，单个Aerolysin纳米孔道的 电流基线(B);5 kHz下，Aerolysin纳米孔道5天稳定性测试的I～V曲线(C)； 5天稳定性测试的不同频率下Aerolysin纳米孔道的电导(D)Fig.3 Schematic diagram of poly(dA)4 detection by an Aerolysin nanopore(A);Current baseline of a single Aerolysin nanopore at different cut-off frequencies(B);I-V curve of an Aerolysin nanopore

Aerolysin纳米孔检测Poly(dA)4得到的原始数据为时间电流曲线(图4A)，定义未通过待测物时刻的电流值为纳米孔道开孔电流I0，当有待测物通过孔道时的残余电流值为I，持续时间为阻断时间(Duration time)，待测物过孔的残余电流程度为I/I0。统计分析过孔信号的时间和电流可以得到不同电压下待测物过孔的阻断时间、残余电流程度等信息，并绘制了阻断时间统计直方图、残余电流程度统计直方图(图4B、C)。统计不同电压(100、120、140、160、180 mV)下的阻断信息，阻断时间分别为(7.33±0.15)、(4.85±0.28)、(3.53±0.05)、(2.53±0.04)、(2.23±0.04) ms；残余电流程度分别为0.48±0.00、0.50±0.01、0.52±0.01、0.55±0.00、0.57±0.01。图4D为利用商品化仪器获取不同施加电压下的阻断信号，并选取与Cube仪器得到的相同个数的信号，绘制残余电流程度统计直方图，其残余电流程度分别为0.47±0.01、0.50±0.01、0.52±0.01、0.55±0.01、0.57±0.01。分别对比Cube纳米孔道仪器和商品化仪器在不同施加电压下获取信号的残余电流程度，两者数值误差均不超过0.01，说明Cube纳米孔道仪器可应用于纳米孔道分析实验。

图4 Poly(dA)4通过Aerolysin纳米孔道的原始电流轨迹图(A)；不同电压下，Poly(dA)4的阻断时间(B)和残余 电流程度(C)统计直方图；商品化仪器得到的Poly(dA)4在不同电压下的残余电流程度统计直方图(D)Fig.4 Original current traces of Poly(dA)4 traversing across an aerolysin nanopore(A);Statistical histograms of duration times(B) and residual current blockages(C) at different voltages;Statistical histograms of residual current blockages at different voltages obtained by commercial instrument(D)

进一步分析Cube纳米孔道仪器在100 mV下获取的Poly(dA)4穿过Aerolysin纳米孔道信号，其残余电流程度为0.48±0.01。文献使用商品化仪器在相同条件下所得的残余电流程度为0.48±0.01[25]，两者残余电流程度一致，结果高度吻合。进一步表明基于Cube纳米孔道仪器的生物纳米孔实验具备高度可重复性，数据结果准确可靠。

如图5所示，采用Cube纳米孔道仪器在1周的不同3天进行稳定性纳米孔实验。对获取信号的残余电流程度和阻断时间进行统计分析并拟合，得到不同时间测得同一施加电压下的残余电流程度，其标准偏差均小于0.004，占残余电流程度的百分比，即对残余电流程度测量影响小于0.6%。本实验中，Poly(dA)4信号的阻断时间随电压升高而减小，因此其在180 mV电压下具有最小的阻断时间。通过比较在180 mV电压下阻断时间标准偏差占相应阻断时间的百分比，显示其最大值仅为2.8%，说明Cube纳米孔道仪器检测误差对瞬时纳米孔信号的失真度影响小，具有高准确性。

图5 以Aerolysin测量Poly(dA)4为例时，Cube纳米孔道仪器的稳定性测试;不同电压下Poly(dA)4残余电流阻断 程度(A)和阻断时间(B)的统计平均值Fig.5 Instrument stability test of Cube nanopore instrument for aerolysin detection of Poly(dA)4;Averaged statistical residual current blockages(A) and duration times(B) of Poly(dA)4 under different voltages

3 结 论

本研究主要考察了Cube纳米孔道仪器的稳定性及其在纳米孔道检测中的应用。在截止频率为5、10、100 kHz条件下，电流基线的噪音均方根(RMS)值分别比商品化仪器减小了80.0%、87.5%、48.2%，说明Cube纳米孔道仪器的抑制噪音能力更强，仪器测量稳定性更好。在连续稳定性测试中，Cube由I～V曲线得到在5、10、100 kHz截止频率下电阻的电导为(1.00±0.01)、(1.00±0.01)、(1.00±0.01) nS，测量误差均小于1.0%，而商品化仪器得到电导为(0.94±0.01) nS，说明Cube纳米孔道仪器满足纳米孔道实验对仪器的稳定性要求。在纳米孔道检测的应用中，通过Aerolysin纳米孔道检测Poly(dA)4的实验对比了Cube仪器和商品化仪器在不同施加电压下获取的单分子信号残余电流程度，两者误差均小于0.01；100 mV时待测物Poly(dA)4过Aerolysin纳米孔的信号经统计得到的残余电流程度为0.48±0.01，与文献结果一致[25]，说明检测结果具有较高的可重复性。Cube纳米孔道仪器凭借其高带宽、噪音低、体积小的优势以及其特殊的分体式结构设计，保证了其电流检测的稳定性，能够实现在实验室环境外的便携式现场快速纳米孔道检测，以期可应用于临床即时检验等。