基于液相色谱-质谱法的不同花期金银花代谢组学分析

李丽丽，李 月，卢 恒，王 晓

(齐鲁工业大学(山东省科学院)，山东省分析测试中心，山东省大型精密分析仪器应用技术重点实验室， 山东 济南 250014)

金银花是忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花，是药食同源的大宗中药材。其药用历史悠久，具有清热解毒、疏散风热的功效，用于痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒和温病发热等症，效果显著。体内外药理学实验发现，金银花提取物具有显著的抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等作用[1-2]。

代谢组学是通过考察生物体系受外界刺激或扰动后其代谢产物的变化来研究生命体系的一门科学[3-4]，与强调系统效应的中医药具有天然的趋同性[5-6]。代谢物作为生物学事件物质基础的终端，其变化与生物表型最为接近，更能直接准确地反映生理状态[7-8]。植物代谢组学是代谢组学的一个重要分支[9]。植物中具有丰富的初生代谢物和次生代谢物[10-11]。次生代谢与初生代谢密切相关，初生代谢为次生代谢提供原料和能量。金银花具有丰富的化学成分，已从金银花中分离得到140多种成分[1]。然而已报道的金银花研究往往是靶向性研究，仅关注有限化合物，如酚酸类成分、黄酮类成分[12-13]、色素类成分[14]、环烯醚萜苷类成分[15]。金银花非靶向代谢组学(初生代谢和次生代谢)的研究鲜有报道。

已有研究指出不同采收期金银花的质量不同，其绿原酸和木犀草苷的含量有显著差异[16]。金银花的药效成分与其初生和次生代谢密切相关，通过金银花的代谢组学研究，探究不同花期成分的变化规律，可为金银花药效成分代谢调控机制的深入研究及质量提升提供理论指导。液相色谱-质谱法(LC-MS)是目前植物代谢组学分析中应用最为广泛的分析方法[17-19]。本研究拟通过优化金银花的提取方法，建立基于LC-MS的金银花代谢组学分析方法，对金银花中的初生和次生代谢物进行定性分析,并应用于不同花期金银花的样品分析，以探究不同花期的代谢差异。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱仪(ACQUITY,H-Class,美国沃特世公司 )，飞行时间质谱(Q-TOF MS,Impact Ⅱ,德国布鲁克公司)。乙腈、甲醇(色谱级，德国默克公司);甲酸(色谱级，德国Honeywell Fluka)。标准品：绿原酸、新绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、木犀草苷、芸香苷、色氨酸、苯丙氨酸、硬脂酸(FA18∶0)(纯度≥98%)，均购于上海源叶生物科技有限公司。超纯水由Millipore Direct-Q 8 UV-R超纯水系统(美国)制备。

1.2 样品信息

金银花采自山东省临沂市平邑县实验基地。植株经王晓教授鉴定为忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.，品种为大毛花。2018年5月，分别采摘三青期(5-17)、二白期(5-18)、大白期(5-19)、银花期(5-21)和金花期(5-22)的金银花样品。每个花期的样品平行6份，采摘后立即放入液氮中保存。等量称取不同花期的金银花样品，混合均匀，制备质量控制样品(QC)。

1.3 样品制备

将不同花期的金银花在液氮下研磨成粉末。准确称取300 mg样品于2 mL eppendorf 管中，加入1.5 mL 提取试剂，涡旋5 min，离心10 min，取上清液。

1.4 LC-MS分析条件

色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq C18柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm，美国Agilent公司)，流速为0.3 mL/min，柱温为45 ℃，流动相：A为0.1%甲酸的水溶液，B为乙腈。洗脱梯度：起始梯度为5% B；10 min，线性升至25% B；15 min，线性升至95% B，维持5 min；最后降至5%B，维持5 min。总时间为25 min。

质谱使用电喷雾离子源。离子源参数：毛细管电压，正离子模式下3 500 V，负离子模式下3 000 V；干燥气流速为8 L/min；雾化气压力为200 kPa；干燥气温度为200 ℃。四极杆离子能量为3 eV。碰撞池参数：碰撞能为7 eV，传输时间为60 μs，碰撞池射频电压振幅为750 Vpp，脉冲前等待时间为5 μs。质量数扫描范围m/z50～1 500。二级质谱分析时碰撞能为10～50 eV。

1.5 数据处理

由LC-MS分析得到的原始数据使用MSDIAL软件[20]获得峰值表(质量数、保留时间、峰面积)。主成分分析(PCA)由SIMCA软件(瑞典)完成。非参数检验由SPSS软件(美国)完成。聚类分析由MEV软件(美国)[21]完成。

2 结果与讨论

2.1 金银花代谢组学分析方法的建立

使用不同体积比的甲醇-水溶液(7∶13、9∶11、11∶9、13∶7、3∶1、17∶3和19∶1)对金银花进行提取，每个提取条件平行6份样品。分别进行正离子模式和负离子模式下的LC-MS分析，以峰面积(S/N>3)和峰个数评价提取效率。如图1所示，随着甲醇比例的提高，峰个数和峰面积均显著增加。正离子模式下，甲醇与水的体积比为3∶1时峰面积和峰个数达到最大；负离子模式下，峰个数在甲醇与水的体积比为3∶1时达到最大，而峰面积在体积比为17∶3时达到最大，但峰个数有所下降。考虑到金银花中含有丰富的亲水性糖苷类成分，选择提取试剂为甲醇-水(3∶1)。

2.2 方法学考察

平行处理6份QC样品，用甲醇-水(3∶1)提取后进行LC-MS分析，每间隔4 h分析1个样品，以考察分析方法的重复性和精密度。计算每个峰在6个样品中峰面积的相对标准偏差(RSD)，并统计不同RSD范围(0～10%、10%～20%、20%～30%、>30%)内的峰个数，以及相应的峰面积之和；计算不同RSD范围内的峰个数占比，以及累计峰面积占比。结果显示，在正离子模式下，95.7%的峰的RSD在30%以内，峰面积占比为97.0%；在负离子模式下，97.5%的峰的RSD在30%以内，峰面积占比为96.8%。结果说明方法的重复性和精密度良好，满足代谢组学分析的要求。金银花的LC-MS总离子流图见图2。

2.3 金银花代谢物定性分析

根据质量数、保留时间和二级质谱数据对金银花中的初生代谢物和次生代谢物进行定性分析。将二级质谱数据与数据库进行比对，对有标样的化合物使用标样验证。应用的数据库包括Metlin(metlin.scripps.edu)、MassBank(massbank.jp)、Bruker MetaboBASE Personal library等。在金银花中定性出氨基酸(8个)、核苷(11个)、脂肪酸(34个)、脂质(25个)等初生代谢物以及酚酸(16个)、黄酮(30个)、环烯醚萜苷(10个)次生代谢物共157个代谢物(见表1)。其中次生代谢物的二级质谱有其特定的裂解规律。

单咖啡酰奎宁酸(绿原酸、新绿原酸)和二咖啡酰奎宁酸(异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C)是金银花中主要的酚酸类代谢物。二级质谱分析有明显的咖啡酸裂解特征：子离子m/z163、145、135和117。二咖啡酰奎宁酸还会出现丢失1个咖啡酰基的子离子(m/z337，[M+H-Caffeoyl-H2O]+)。在金银花中还定性出香豆酸衍生物、香豆素衍生物、阿魏酸、奎宁酸等酚酸代谢物。

金银花中的黄酮类成分大多以糖苷形式存在。黄酮苷元大多与1个糖或2个糖结合。糖苷配体主要是己糖、脱氧己糖和五碳糖，二级质谱分析时会出现中性丢失糖苷配体的裂解特征，分别对应中性丢失m/z162、146和132。如木犀草苷由木犀草素和葡萄糖组成，在二级质谱分析时特征子离子为[M+H-162]+。芸香苷是含有2个糖的糖苷，糖基配体由1个脱氧己糖和1个己糖组成，在二级质谱分析时特征子离子为[M+H-146]+和[M+H-146-162]+。在金银花中鉴定出芹菜素、槲皮素、木犀草素、柚皮素、异鼠李素、山奈酚等苷元。

环烯醚萜苷在一级质谱分析时大多会出现[M+H]+、[M+Na]+、[2M+H]+和[2M+Na]+信号。如断马钱子酸出现m/z375、397、749和771信号。环烯醚萜苷在二级质谱分析时具有丰富的子离子，会出现中性丢失162(糖苷)、18(H2O)、26(C2H2)、28(CO)、44(CO2)的特征子离子[22-23]。如断马钱子酸在二级质谱分析时的子离子主要是 213[M+H-162]+、195[M+H-162-18]+、177[M+H-162-18-18]+、151[M+H-162-18-18-26]+、125[M+H-162-18-18-26-26]+、107[M+H-162-18-18-26-26-18]+。金银花中定性出马钱苷酸、 獐牙菜苷、马钱子苷等环烯醚萜苷类代谢物。

表1 金银花中定性的代谢物Table 1 The identified metabolites in Lonicera japonica

(续表1)

2.4 不同花期金银花代谢组学分析

三青期(S1)、二白期(S2)、大白期(S3)、银花期(S4)、金花期(S5)金银花样品的主成分分析(PCA)得分图如图3所示，可以看出不同花期的金银花在主成分1(PC1)有明显分离。在正离子模式数据进行PCA分析时，PC1为0.451;在负离子模式数据进行PCA分析时，PC1为0.482。

对不同花期金银花样品中已定性代谢物做非参数检验，得到p值，并计算两组之间的比值。筛选p<0.05和比值>1.5的代谢物为有显著性差异的代谢物。结果显示，在金银花的生长过程中，氨基酸代谢、核苷代谢、脂肪酸代谢、脂质代谢、多酚代谢等发生了明显变化。

将差异代谢物绘制热图。图4为次生代谢物的热图，由图可见酚酸类、黄酮类和环烯醚萜苷类代谢物的含量随着花期的增加而总体呈下调趋势。酚酸类代谢物在S2和S3有显著性差异，在大白期其含量明显下降。大部分黄酮类代谢物在S2和S3有显著性差异，在大白期含量明显下降。其中，芹菜素及其糖苷类代谢物在S4和S5出现显著上调，在开花期含量增加。环烯醚萜苷类代谢物在S3和S4有显著性差异，受开花的影响较大。

图4 差异次生代谢物的热图分析Fig.4 Heat map of differential secondary metabolites A：phenolic acids(酚酸类)，B：flavonoids(黄酮类)，C：iridoids (环烯醚萜苷类)； red represent higher content and green represent lower content

图5 差异初生代谢物的热图分析Fig.5 Heat map of differential primary metabolites A：amino acids(氨基酸类)，B：nucleosides(核苷类)，C：lipids(脂质),D：fatty acids(脂肪酸类)； red represent higher content and green represent lower content

初生代谢物的热图如图5所示。由图可见氨基酸类代谢物在S4和S5有显著性差异，在金花期的含量明显下降。核苷类代谢物在S4期开始下降。脂质中大部分溶血磷脂酰胆碱(Lyso PC) 和溶血磷脂酰乙醇胺(Lyso PE)的含量随着花期的增加而上调，在银花期和金花期显著增加。磷脂酰胆碱(PC)随着生长发育期其含量显著下调。大部分脂肪酸(FA)随着生长发育期其含量上调，而氧化脂肪酸(OxFA)的含量下降。

3 结 论

本研究建立了基于LC-MS的金银花代谢组学分析方法，并对金银花中的初生代谢物和次生代谢物进行了定性分析。该方法具有良好的重复性和精密度。将该方法应用于不同花期的金银花代谢组学分析，揭示了初生代谢物和次生代谢物在不同花期的代谢规律，为金银花的种植和采收提供了科学依据。