一种基于苯并噻唑的新型过氧亚硝酸盐荧光探针的合成及应用

张春香，王慧平，刘梦琴，申有名，谷 标*

(1.湖南文理学院 化学与材料工程学院，湖南 常德 415000;2.衡阳师范学院 化学与材料科学学院， 功能金属有机化合物湖南省高校重点实验室，湖南 衡阳 421008)

过氧亚硝酸盐(ONOO-)是生命体中一种典型的活性氮物质(RNS)，内源性ONOO-由一氧化氮和超氧自由基在体内偶联反应生成[1]。ONOO-在信号传导中扮演着十分重要的角色，并表现消炎和杀菌作用。研究表明，体内异常浓度的ONOO-与各种临床疾病有关，如炎症、心血管疾病、阿尔茨海默病和癌症[2]。另外，由于具有强的氧化性，ONOO-会引起生物分子(包括细胞、蛋白质、脂类和核酸)受损，导致细胞凋亡或坏死[3]。因此，开发高效的生物系统中ONOO-的检测方法对于更好地了解其生理及病理学功能具有重要意义。

在众多方法中，荧光探针因具有灵敏度高、特异性强、无损检测和实时监测等优点，被认为是一种很有前途的活体检测方法[4]。迄今为止，已报道了许多以硼酸酯[5-6]、硒或碲[7-8]、肼[9]、N-(4-羟基苯基)氨基[10-11]、二苯基膦[12-13]、碳氮双键[14]作为ONOO-识别基团的荧光探针。虽然目前已在ONOO-检测与成像方面取得了一些进展，但仍存在一些值得关注的问题。其一，体内ONOO-生命周期短(<10 ms)[15]，设计的探针应能在温和的条件下快速响应ONOO-。然而，大多数ONOO-探针在检测时表现出延迟响应(≥5 min)[16-18]，难以捕获瞬态的ONOO-，不利于生物系统中ONOO-的实时、原位检测。其二，细胞内ONOO-的稳态浓度估计在nmol范围内，而化学活性相近的其他活性氧物种(ROS，如ClO-和H2O2)的稳态浓度在μmol范围内，构建的探针应对ONOO-具有足够高的选择性和灵敏性。遗憾地是，已报道的一些ONOO-探针表现出对其它RNS/ROS的选择性不足[19]，极大地限制了其实际应用[20]。另外，一些探针合成复杂、纯化困难、成本高昂，不利于推广使用。因此，开发一种能解决上述问题的ONOO-荧光探针尤为必要。

2-(2′-羟基苯基)苯并噻唑及衍生物(HBT)作为荧光信号基团具有许多显著的光物理和化学性质，如Stokes位移大、荧光量子产率高、光稳定性好、结构易修饰等[21]。鉴于目前ONOO-荧光探针存在的不足及苯并噻唑衍生物优异的荧光性能，本文制备了一种2-(2′-羟基-3′-(1,1-二甲基腙)-5′-甲基苯基)苯并噻唑(BD)探针，该探针以HBT为荧光基团，1,1-二甲基腙为识别基团。探针BD由于识别基团上的N—N单键旋转产生非辐射能量损失，导致荧光较弱。但在ONOO-氧化下，BD上的腙被水解成醛基，N—N单键脱落，荧光恢复。且探针BD对ONOO-的识别具有响应快、灵敏度高和选择性好的特点。此外，该探针具有良好细胞渗透性，适用于肝癌细胞中内源性ONOO-的荧光成像。本研究为生物体内ONOO-的识别与成像提供了一种可靠、有效的分析方法。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

核磁共振氢谱和碳谱由Bruker AVANCE-500M型核磁共振仪测得。高分辨质谱通过Brucker APEX IV(7.0 T)FTMS型高分辨质谱仪测得。紫外光谱和荧光光谱分别在UV-2600型紫外-可见分光光度计(Shimazu Co,Japan)和RF-5301PC型荧光分光光度计(Shimazu Co,Japan)上测定。细胞成像在共聚焦荧光显微镜(Leica TCS SP8,Germany)下拍摄。

1.2 探针BD的合成与表征

取一洁净的圆底烧瓶(50 mL)，向其中依次加入BA(269 mg,1.0 mmol)、1,1-二甲基肼(83 μL,1.1 mmol)、哌啶(100 μL)和乙醇(15 mL)，然后将混合物回流反应12 h。待反应结束后，有固体析出，静置1 h 后，用布什漏斗过滤。滤渣用乙醇冲洗3次后，得到纯净的淡黄色化合物BD(283 mg,91%)。1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ13.10(s,1H),8.14(d,J=7.6 Hz,1H),8.07～8.05(m,2H),7.70(s,1H),7.55(t,J=8.0 Hz,2H),7.45(t,J=8.0 Hz,1H),7.39(d,J=7.6 Hz,1H),2.98(s,6H),2.53(s,3H)。13C NMR(126 MHz，CDCl3)：δ163.6、153.3、151.9、136.0、135.5、132.0、128.6、127.8、126.8、125.4、122.7、122.4、121.5、119.5、43.0、20.6。化合物BD(C17H18N3OS+)的理论相对分子质量为312.116 5，实测值为312.117 4。

1.3 光谱测试

样品溶液的配制：向2 mL测试管中加入20 μLBD母液和适量体积的分析物母液(1 mmol/L)，再用PBS溶液(DMSO∶H2O=2∶8，体积比，pH 7.4)稀释至刻度。然后转移至比色皿(1 cm)中进行光谱测试。在测试荧光发射光谱时，激发波长设定为425 nm。

1.4 细胞成像

将HepG2(肝癌细胞)细胞放置在培养液中(含100 g/mL链霉素和100 U/mL青霉素以及10%小牛胚胎血清)培养，细胞培养箱温度设置为37 ℃，CO2含量设定为5%。在进行成像实验之前，将HepG2细胞转移至96孔板中生长24 h。取一部分HepG2细胞与BD(10 μmol/L)共孵育30 min，作为空白组;另取一部分HepG2细胞与BD(10 μmol/L)共孵育30 min后，再与SIN-1(200 μmol/L，一种诱导细胞产生ONOO-的刺激物)共孵育30 min，作为实验组。用温热的PBS溶液(37 ℃，pH 7.4)冲洗细胞外残留的探针。最后，在共聚焦荧光显微镜下观察并拍摄两组细胞的明场图和荧光图。

2 结果与讨论

2.1 光谱表征

为了考察探针BD对ONOO-的响应情况，测定了BD与ONOO-反应前后的紫外光谱和荧光光谱。结果如图1所示，探针在358 nm处有1个明显的紫外吸收峰(εmax=0.59 ×104L·mol-1·cm-1)。然而，在加入ONOO-后，此处的吸收峰消失，与此同时，在425 nm处产生新的吸收峰(εmax=1.48×104L·mol-1·cm-1)，说明探针BD与ONOO-发生了化学反应。探针BD自身荧光较弱(Φ=0.011，硫酸喹啉(Φs=0.58)作为标准物)，可能是因为其结构上的N—N单键旋转产生了非辐射能量损失。然而，在探针BD溶液中加入ONOO-后，于528 nm处出现1个明显的荧光发射峰(Φ=0.316，硫酸喹啉(Φs=0.58)作为标准物)，这可能是由于探针BD在ONOO-氧化下，识别基团脱落，有效地抑制了N—N单键旋转所产生的辐射能量损失。此外，探针BD与ONOO-反应后，Stokes位移高达103 nm，在荧光测试中可有效避免自身荧光吸收和内滤效应。如图1插图所示，探针BD与ONOO-混合后产生明显的颜色变化，进而证明探针BD与ONOO-反应产生了新的荧光物质。上述实验结果表明探针BD可以用来检测ONOO-。

2.2 检测机理

探针BD以苯并噻唑为荧光基团，1,1-二甲基腙为识别基团，基于BD与ONOO-反应前后的光学变化，推测BD上的腙被ONOO-氧化水解成醛基，最终生成化合物BA。为了证实这一推断，考察了BD与ONOO-反应前后的高分辨质谱，结果如图2所示。BD在m/z=312.117 4处有1个强的分子离子峰。然而，与ONOO-反应后，在m/z=270.059 0处出现1个新的、强的分子离子峰，该数值与化合物BA的理论相对分子质量(m/z=270.058 3)一致，表明探针确实被ONOO-氧化水解成化合物BA。因此，提出如下检测机理(图3)：探针BD由于存在N—N单键旋转，荧光较弱;然而在ONOO-存在下，BD上的腙被氧化水解化成醛，N—N单键脱落，荧光恢复。根据检测体系荧光强度与ONOO-浓度的相关性，可实现对ONOO-的定量检测。

图3 探针BD检测过氧亚硝酸盐的机理示意图Fig.3 The detection mechanism of ONOO- by probe BD

2.3 条件优化

为了获得最佳的灵敏度，对反应时间和溶液pH值进行了优化。如图4A所示，探针BD与ONOO-在25 s内反应完全，如此快的响应为机体内ONOO-的实时、原位检测提供了保障。pH值的影响如图4B所示，在整个pH值范围内，探针BD对ONOO-具有较稳定的荧光响应，表明BD适用于生理pH值范围。因此，在后续实验中，选择25 s作为探针与ONOO-的反应时间，pH 7.4 的PBS 缓冲溶液作为检测介质。

2.4 灵敏性

在最佳检测条件下，测试了探针BD(10 μmol/L)与不同浓度的ONOO-(0～14 μmol/L)反应后的荧光光谱。随着ONOO-浓度的增加，荧光发射光谱不断上升。当ONOO-的浓度超过10 μmol/L后，荧光达到饱和。更重要的是，检测体系在528 nm处的荧光强度(Y)与ONOO-的浓度(X，0～10 μmol/L)呈现良好的线性关系，线性方程为Y=0.090 42X+0.092 27，线性系数为0.999 87。根据检出限计算公式[24]，得到方法检出限为7 nmol/L。与文献报道的其他ONOO-探针相比(表1)，探针BD具有较低的检出限和较快的反应速度。

表1 检测ONOO-荧光探针的比较Table 1 Comparison of ONOO-fluorescent probes

2.5 选择性

2.6 细胞成像

为了探究探针BD的生物应用，进行了活细胞荧光成像实验。结果如图6所示，当HepG2细胞与BD(10 μmol/L)共孵育30 min后，细胞内部荧光较弱(图6A下图)。然而，将负载BD的HepG2细胞与SIN-1(200 μmol/L)继续孵育30 min后，可以观察到明显的绿色荧光(图6B下图)。通过明场成像图(图6B上图)可知，细胞形态正常，说明BD具有优异的生物相容性，可用于活细胞中内源性ONOO-的荧光成像。

3 结 论

本研究以苯并噻唑为荧光基团，1,1-二甲基腙为识别基团，设计并合成了一种新型ONOO-荧光探针BD。该探针简单易得，产率较高(91%)，对ONOO-的荧光分析具有响应快速(25 s)，检出限低(7 nmol/L)和选择性高的优势。荧光成像结果证实探针BD可用于活细胞中ONOO-的实时、原位检测。本工作为深入研究机体内与ONOO-相关的生理与病理功能提供了一种强有力的方法。