红背叶根对乙醇诱导的酒精性脂肪肝细胞模型的影响*

沈海容，王大东，罗显克，王保健，吴晓莉，农云翠

广西壮族自治区民族医院:1.消化内科二区；2.消化内科一区，广西南宁 530000

目前，我国成人脂肪肝发病率为12.5%～35.4%，且有逐年上升趋势，而由饮酒过量引起的酒精性脂肪肝的发病率也越来越高[1]。酒精性脂肪肝发生肝纤维化和肝硬化的进程相对较快，并可能进展为肝癌。因此，积极研发治疗酒精性脂肪肝的药物对临床意义重大。本课题组前期研究表明，红背叶根对肝纤维化大鼠具有保肝、降酶和抗肝纤维化的作用[2-3]，但是酒精性脂肪肝离体细胞模型研究尚未开展。本研究采用乙醇诱导的酒精性脂肪肝离体细胞模型，进一步探讨了红背叶根对酒精性脂肪肝的影响，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1材料 红背叶根采自广东惠州，经南方医科大学中药鉴定与药用植物教研室鉴定为大戟科植物红背山麻杆的根。红背叶根水提物提取步骤：红背叶根干燥粉碎后，用蒸馏水溶解，离心取上清液，60 ℃水浴消毒3次。L02细胞(人胎肝细胞系)购自中国科学院上海细胞库。

1.2仪器与试剂 高糖DMEM培养液购自美国Invitrogen公司；小牛血清(56 ℃、30 min灭活)购自浙江天杭生物科技有限公司；谷氨酰胺、四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司；0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸、青-链霉素溶液购自吉诺生物医药技术有限公司；Biotek ELx800全自动酶标仪购自美国Biotek公司；Olympus Bx60倒置显微镜购自日本奥林巴斯公司。

1.3方法

1.3.1细胞培养 L02细胞复苏后用含10%小牛血清的DMEM培养液转入玻璃培养瓶中，置于5% CO2、37 ℃的培养箱中饱和湿度条件下常规方法培养，2 d换液1次，3～4 d用0.25%胰蛋白酶消化，1∶3传代培养。

1.3.2乙醇诱导建立酒精性脂肪肝L02细胞模型 将处于对数生长期的L02细胞消化后，以每孔5×104个细胞接种于96 孔板，培养4 h，待细胞贴壁后，更换培养液为含10% 小牛血清和不同水平乙醇(20、40、60、80、100 mmol/L )的DMEM培养液(乙醇组)，设置不含乙醇的培养液为对照组。在20 h 时，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL。继续培养4 h，弃去培养液，每孔加入DMSO 200 μL，震荡5 min后，采用酶标仪检测490 nm波长处吸光度(A)值。乙醇组细胞存活率=A乙醇组/A对照组×100%。

1.3.3红背叶根对酒精性脂肪肝L02细胞模型中细胞存活率的影响 以80 mmol/L乙醇建立的酒精性脂肪肝L02细胞模型作为模型组(80 mmol/L乙醇处理L02细胞时，细胞存活率大于50%，因此选取该水平乙醇建立酒精性脂肪肝L02细胞模型)；分别用不同水平的红背叶根水提物(12.500、6.250、3.125、1.560、0.780 mg/mL )作用于80 mmol/L乙醇建立的酒精性脂肪肝L02细胞模型(红背叶根组)。在给药20 h 时，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，继续培养4 h后，弃去培养液，每孔加入DMSO 200 μL，震荡5 min后，采用酶标仪检测490 nm波长处A值。模型组细胞存活率=A模型组/A对照组×100%，红背叶根组细胞存活率=A红背叶根组/A对照组×100%。

1.3.4丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)水平检测 选取红背叶根组中能使酒精性脂肪肝L02细胞模型中细胞存活率超过50%的红背叶根水提物3个水平(3.125、1.560、0.780 mg/mL)下的细胞上清液，以及对照组、模型组的细胞上清液，进行细胞上清液中ALT、AST、GGT水平检测。操作方法：细胞培养液以1 500 r/min离心5 min，取上清液备用；严格按各试剂盒使用说明书进行操作。

1.3.5超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平检测 选取红背叶根组中能使酒精性脂肪肝L02细胞模型中细胞存活率超过50%的红背叶根水提物3个水平(3.125、1.560、0.780 mg/mL)下的细胞上清液，以及对照组、模型组的细胞上清液，按照试剂盒说明书操作，采用酶标仪检测450 nm波长处SOD水平，检测532 nm波长处MDA水平。

2 结 果

2.1不同水平乙醇对L02细胞存活率的影响 随着乙醇水平升高，L02细胞的存活率逐渐下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2红背叶根对酒精性脂肪肝L02细胞模型中细胞存活率的影响 红背叶根组中，随着红背叶根水提物水平逐渐降低，酒精性脂肪肝L02细胞模型中细胞存活率逐渐升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 不同水平乙醇对L02细胞存活率的影响

表2 红背叶根对酒精性脂肪肝L02细胞模型中细胞存活率的影响

2.3各组ALT、AST、GGT水平比较 与对照组比较，模型组酒精性脂肪肝L02细胞模型的细胞上清液中ALT、AST、GGT水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，红背叶根组3个水平(3.125、1.560、0.780 mg/mL)下，酒精性脂肪肝L02细胞模型的细胞上清液中ALT、AST、GGT水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.4各组SOD、MDA水平比较 与对照组比较，模型组酒精性脂肪肝L02细胞模型的细胞上清液中SOD水平明显降低，MDA水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，红背叶根组3个水平(3.125、1.560、0.780 mg/mL)下，酒精性脂肪肝L02细胞模型的细胞上清液中MDA水平明显降低，SOD水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表3 各组ALT、AST、GGT水平比较

表4 各组SOD、MDA水平比较

3 讨 论

脂肪肝可分为酒精性脂肪肝与非酒精性脂肪肝。研究脂肪肝的发病机制时常用到酒精性脂肪肝细胞模型和非酒精性脂肪肝细胞模型。研究表明，动物模型存在个体差异较大，实验条件不易控制，整体影响因素众多等不利因素，而建立细胞模型能克服动物模型个体差异的影响，更好地控制实验条件，能针对性地探讨脂肪肝发病的细胞机制，且能有效缩短筛选治疗药物的时间[4]。本课题组前期研究已使用动物模型探讨过红背叶根的保肝机制[2-3]，但未进行过离体细胞模型的研究，且目前相关临床研究较少，因此，在本研究中采用酒精性脂肪肝离体细胞模型初步探讨了红背叶根对酒精性脂肪肝的影响。

本研究中，随着乙醇水平升高，L02细胞的存活率逐渐下降，提示在酒精性脂肪肝的发生、发展过程中，乙醇导致的肝损伤起到关键作用。本研究红背叶根组中，随红背叶根水提物水平的逐渐降低，乙醇诱导的酒精性脂肪肝L02细胞模型中细胞存活率逐渐升高，当其水平为1.560、0.780 mg/mL时，其所对应的细胞存活率高于模型组，提示该水平下红背叶根具有一定的保肝作用，与本课题组前期的动物模型研究结果一致。

脂质过氧化及氧化应激是急性肝损伤的一个发病机制。肝细胞发生过氧化损伤时，细胞膜通透性增加，ALT和AST从肝细胞内释放，细胞培养液中的ALT和AST水平升高[5]。ALT主要存在于肝细胞的细胞质中；AST主要存在于肝细胞的细胞质和线粒体中；GGT分布于肝细胞膜，乙醇能诱导微粒体生物转化，使GGT水平升高。ALT、AST及GGT是肝细胞内的非特异性功能酶，当细胞发生损伤时其水平升高[6-7]。乙醇及其代谢物乙醛能促进脂质过氧化和线粒体的损伤，从而引起肝细胞损伤，使相关生化指标产生相应变化[6-8]。本研究结果显示，红背叶根可降低酒精性脂肪肝L02细胞模型的细胞上清液中ALT、AST、GGT水平，提示红背叶根在酒精性脂肪肝离体细胞模型中具有保肝、降酶的作用。

脂质过氧化的主要降解产物MDA可直接与蛋白和DNA结合，使之变性失活，因此MDA常用于反映人体内脂质过氧化的程度及细胞氧化损伤的程度[9]。此外，MDA可严重损伤肝细胞膜结构，导致肝细胞肿胀、坏死[10]。SOD是人体内自由基的重要清除剂，可防止生物膜过氧化引起的毒性作用[11]。据报道，各类型肝病患者SOD水平均明显降低，且其与肝脏病理损伤严重程度有关[12]。本研究结果显示，红背叶根还可以明显降低酒精性脂肪肝L02细胞模型的细胞上清液中MDA水平，明显提高SOD水平，提示红背叶根在酒精性脂肪肝离体细胞模型中具有抗脂质过氧化的作用。

本研究结果为红背叶根在酒精性脂肪肝中的临床应用提供了有力的数据支撑。但本研究的局限性在于使用的是体外实验模型，不能完全模拟体内的生理病理变化。

综上所述，红背叶根在酒精性脂肪肝细胞模型中具有保肝、降酶、抗脂质过氧化的作用，值得进一步临床试验验证后推广应用。