诺氟沙星对水生生物细胞色素P450作用机制研究进展

王宏伟，崔铁峰，张蒙，孙枭琼，方楠

(1.河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002；2. 河北大学 生命科学与绿色发展研究院， 河北 保定 071002)

自青霉素被成功制成可以抗细菌感染的药品以来[1]，人类已经发现的抗生素达4 000多种，其中超过153种得到了实际应用[2].诺氟沙星(norfloxacin，NFLX)是第3代喹诺酮类抗生素，对革兰氏阴性菌有较强的杀伤作用.NFLX凭借其诸多优良属性，在医疗、水产养殖等领域中得到了广泛的应用.现今，随着人们生活品质的不断提高，对水产品的消费越来越多.与此同时，人们对水生生物的抗生素污染情况也越发重视.在日常接触到的水产品中，有相当一部分是人工养殖而来，为了预防和治疗细菌性疾病以及加快水生生物的生长和繁殖，在养殖的过程中会人为地向养殖水体中投放一定量的抗生素.因此，深入研究抗生素对水生生物的影响有着十分重要的现实意义.

1 抗生素研究概况及其污染途径

抗生素的使用为人类与细菌的对抗提供了非常重要的帮助.抗生素虽然不会直接对人体造成伤害，但是对其不合理的使用，尤其是在水体中的过量投放，会加剧耐药性细菌的产生，从而出现毒副作用[3].

抗生素进入到生物机体后，仅有少量在生物体内发生羟基化、裂解和葡萄糖甘酸化等生化反应，成为没有生物活性的代谢产物，而超过90%的抗生素会不经历任何新陈代谢作用，直接排泄到体外[4].这些养殖过程中过量投放和没有经过代谢的抗生素，一小部分会直接渗透到地下水中，其余都会经过地表径流、污水排放系统等最终汇聚到河流和湖泊之中.现阶段常规水污染处理技术还很难将水体中的抗生素彻底清除.因此，抗生素在河流和湖泊中形成蓄积性污染[5]，并在水生生物中富集、放大，最终沿着食物链影响到人类.

2 NFLX的研究概况

2.1 理化性质

图1 NFLX的结构式Fig.1 Structural formula of norfloxacins

NFLX的化学结构如图1所示，分子式为C16H18FN3O3.NFLX为白色至淡黄色的结晶粉末[6]，味微苦；难溶于水或乙醇，在二甲基甲酰胺中略溶，在醋酸、盐酸、烟酸或氢氧化钠溶液中易溶[5].

2.2 作用机理

NFLX的作用位点为细菌的DNA促旋酶，可使细菌DNA发生曲旋状开裂[7]，抑制细菌生长和繁殖，进而达到杀灭细菌的目的.NFLX作为第3代喹诺酮类药物，具备抗菌谱广、作用性强的特点，尤其对铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肺炎克雷白杆菌、奇异变形杆菌等革兰氏阴性菌效果明显.在实际应用中常常使用其乳酸盐和烟酸盐[6]，以保证NFLX在动物体内得到更好的吸收.

2.3 应用现状

喹诺酮类药物具有广谱、高效、毒副作用小以及不易产生耐药性等优良属性，在水产养殖中被广泛使用.而NFLX作为喹诺酮类抗菌药物的代表品种[8]，更是在水产和畜禽业的实际应用中发挥了极为重要的作用.NFLX对多种水产动物细菌性疾病都有很好的预防和治疗效果.淡水养殖鱼类多种常见病如细菌性败血症、白头白嘴病、打印病和烂鳃病的病原菌对NFLX都有很高的敏感度[9].实践证明NFLX在畜禽体内吸收迅速，但并不完全[10].在对鲤鱼的实验中，NFLX在肾脏中的含量高于其他组织，相应的消除期更长，而血液中的含量非常低[11].

现如今，抗生素滥用的现象非常严重，尤其在亚洲地区，抗生素的滥用情况占世界的70%，而中国的滥用情况占亚洲的70%[12].在临床、医药以及水产养殖过程中，也会有大量的药物直接或间接地进入到水环境中，长时间作用下就会对生活在其中的水生生物造成抗生素污染.这些仍然具备生物活性的抗生素，即使在痕量水平上，也会对当地生态环境造成潜在的威胁[13].

3 细胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)的研究概况

3.1 CYP450简介

CYP450因其在450 nm处有特异吸收峰而得名，主要位于滑面内质网上，是一类广泛分布在生物体内的超基因家族，属于单氧酶的一类.其催化反应按照催化难易程度分为典型催化反应和复杂催化反应[14].CYP450可以催化内源物质的合成和降解以及外源物质的代谢，可以在解毒代谢阶段I发挥重要作用[15].一般来说，外来物质对于CYP450通常表现为复合作用，即低浓度诱导、高浓度抑制.

3.2 CYP450家族

CYP450是临床药物代谢研究的重要对象，涉及药物代谢的亚型主要为CYP1、CYP2和CYP3家族中7种亚型.其中，CYP1家族中存在CYP1A1、CYP1A2和CYP1B1这3种亚型；CYP450酶系中最大的家族CYP2包含了CYP2A、CYP2B、CYP2C、CYP2D和CYP2E共5种亚型；CYP3家族存在4种基因亚型，但是在水生动物研究中应用较少[14-15].

在水生生物相关研究中，CYP450家族中的CYP1A、CYP2B和CYP2E这3个亚家族为主要研究对象.CYP1A与药物在生物体内的相互作用有关[16]，进一步研究CYP1A在NFLX胁迫下的反应，对于分析NFLX对生物的毒理作用有十分重要的意义[17]；CYP2B是在口服药物作用到生物体后，首先出现过敏效应的一类CYP450酶[18].CYP2B可以参与临床上约60%药物的代谢过程，具备将有生物活性和难溶的反应底物催化反应成更加容易排出体外且没有生物活性的代谢产物的功能，从而发挥解毒的功能.这一过程对于研究外界药物在生物体内的代谢和排出均有重要意义;而CYP2E不仅在药物的代谢过程中发挥作用，也参与到了生物体内70余种化学物质的代谢过程，如乙醇等.有研究表明[16]，迄今为止研究的所有动物中，它们CYP2E的反应底物和人类是相同的.所以研究环境因素对动物CYP2E的影响对于人类具有一定的参考价值[19-20].

3.3 CYP450的代谢机制

CYP450参与的生化反应种类繁多[21]：氧化型CYP450 Fe3+与药物的复合作用；接受还原性辅酶II提供的电子，由辅酶II细胞色素C还原酶传递，还原为CYP450 Fe2+[22]；CYP450 Fe2+中的低价铁血红素蛋白可以结合分子氧；接受由还原辅酶Ⅱ NADPH提供的或还原辅酶Ⅰ供给的2个电子；释放离子氧使得药物氧化，余下的离子氧再与氢离子结合生成水[23].

3.4 CYP450介导抗性的分子基础

因为CYP450和药物代谢密切相关，所以生物对于某种药物抗性能力很大程度上取决于相关CYP450酶的数量或质量.包括cyp450基因扩增、突变以及转录的增强等，这些都是影响其数量或质量改变的机制.但结合一些之前的报道，未发现这种改变伴随着基因扩增，所以大部分学者更加倾向于是由于1个或者多个基因突变而引起酶的数量或质量变化,而这种突变引发的具体表象包括CYP450酶的超量表达和氨基酸的替换以及这2种现象的联合作用.这些很有可能是CYP450介导抗性的分子基础[24-25].

4 NFLX对水生生物CYP450的影响

NFLX较强的生物组织穿透力、较高的耐受性和较长的半衰期，使其更容易毒害长期生活在水体中的水生生物.在组织层次上，这种毒害作用会表现得十分复杂，不利于进行研究分析.CYP450可以从分子水平上很好地指示出NFLX对水生生物影响作用从无到有、由轻到重的过程.

4.1 NFLX对CYP450活性的影响

4.1.1 影响机制

外界污染物进入生物体中的转化过程通常包括2个阶段：第1阶段在 Ⅰ 相代谢中，首先由CYP450依赖性的混合功能氧化酶(MFO)将亲脂性底物氧化，把氧引入到底物分子中；第2阶段在 Ⅱ 相代谢中，被氧化的非生物物质和内源性分子相结合，形成低毒且易排出的代谢产物.由此判断，在NFLX长期的诱导和影响下，Ⅰ 相代谢中的CYP450活性可能会有所变化.正因如此，可以根据测定CYP450活性变化来反映生物体受NFLX的胁迫和影响，进而将CYP450作为一种生物标志物，应用到环境污染的早期评价中[26-27].

4.1.2 检测方法

在实际操作中，不是直接测定CYP450的活性大小，而是通过测定其同工酶的活性变化来揭示CYP450的活性变化.常用的酶和反应如下：7-乙氧异吩噁唑酮-O-脱乙基酶 (EROD)，7-乙氧异吩噁唑酮-O-脱乙基反应测定CYP1A活性；氨基比林-N-脱甲基酶( APND)，氨基比林-N-脱甲基反应[27]；红霉素-N-脱甲基酶 (ERND)，红霉素-N-脱甲基反应用来测定CYP2B活性[28]；苯胺-4-羟化酶 (AH)，苯胺-4-羟化反应来测定CYP2E活性[29].

研究对象的选取，可以是解毒作用发生的主要部位如肝脏，还可以是肾脏、肌肉等组织的微粒体.

4.1.3 毒理效应

NFLX对中国圆田螺的毒性实验中[27]，NFLX对田螺CYP450活性的影响存在显著的时间和剂量效应，这种效应虽然在不同组织中表现得有所差异，但都有相似性.即在前期，NFLX可能对一些组织的CYP450活性有诱导作用，但到实验后期,随着NFLX浓度的升高和实验时间的延长，诱导作用转变为抑制作用；NFLX对剑尾鱼的毒性实验中[30]，NFLX对于剑尾鱼CYP450活性的影响存在相当大的雌雄差异，同时在雌雄实验中，两者均表现出了浓度-效应关系，但不同的CYP450亚酶具体表现不同，以雄鱼的CYP3活性为例，在整个暴露过程中都呈现了浓度-效应关系，表现出了不同程度的诱导；在NFLX对中国明对虾的毒性实验中[31]，各剂量的NFLX对中国明对虾鳃和血清中CYP450的整体活性呈现抑制作用，且存在一定的时间和剂量效应，随着NFLX浓度升高，鳃和血清中CYP450酶活性受到的抑制作用也越明显；NFLX对阿部鲻鰕鯱的毒性实验中[32]，实验前期CYP450酶活性受到诱导，但在实验进行到168 h时，阿部鲻鰕鯱肝脏中CYP2B和CYP3A的活性均受到了显著的抑制.

总体来看，在诸多水生生物实验研究中，NFLX对CYP450的影响结果相似，即在实验前期，NFLX可能对一些组织中的CYP450活性存在诱导效应，在实验的中后期随着NFLX浓度的不断提高，NFLX对于组织中的CYP450活性最终表现为抑制作用.对于生活在水体中的水生生物来说，这种随时间延长而积聚的NFLX对生物体组织中CYP450的抑制作用，不仅会阻碍其对于毒性物质的代谢和排泄，而且也会对生物自身的生长和繁殖造成消极的影响.可以想象，这种毒性物质累积的作用会伴随着食物链的物质流动和累积而不断地被放大，最终作用到人类自身，危害人类的健康和安全.

4.2 NFLX对cyp450基因表达的影响

相关研究发现，NFLX不仅会直接对CYP450的活性造成影响，还会对其基因的表达调控有影响[33].NFLX的长期作用，可以影响CYP450正常的mRNA存量，从而干扰CYP450相关基因的正常表达.

4.2.1 检测方法

对于cyp450基因表达情况的检测，常用的方法是实时荧光定量PCR法(quantitative real-tiwe PCR,qPCR).通过qPCR检测在NFLX胁迫下CYP450相关mRNA的相对表达量，利用EROD活性和CYP1AmRNA表达量存在正相关关系[30]这一特点，同时检测EROD酶的活性大小，研究NFLX对cyp450基因表达的影响.EROD的活性大小，可以采用荧光分光光度计测定，探针可以使用7-羟基-3-异吩噁唑酮(RF)等.

4.2.2 毒性效应

结合之前NFLX对剑尾鱼的实验可知，NFLX对于剑尾鱼肝脏中CYP450酶系中Ⅰ相、Ⅱ相代谢酶活性与mRNA相对表达量的效应具有一致性[30]，这证明了NFLX的添加确实影响了CYP450酶系中cyp1a基因的表达,而这种影响在雌雄体之间差异明显.以雄性个体为例，高浓度NFLX对雄鱼肝脏中cyp1a基因的表达有诱导作用，而且表现出一定的浓度-效应关系；NFLX对阿部鲻鰕鯱的实验[32]，结果显示，在各个暴露时间段，CYP1AmRNA的表达量总体受到诱导并且呈现出“钟形曲线”的变化趋势，即随着NFLX浓度的增加，CYP1AmRNA的表达量先是受到诱导，后来随着NFLX浓度的提高诱导的程度有所下降；在NFLX对牙鲆的毒性实验中[33]，发现CYP450的一些同工酶的活性明显受到抑制，同时qPCR结果表明，NFLX抑制了CYP450部分基因的表达.

这些都表明NFLX对于cyp450基因表达的影响存在一定的时间和剂量效应，而且这种效应在雌雄个体之间有着显著差异.这种对于CYP450酶系非正常的干扰作用，会造成生物体代谢功能紊乱，影响细胞和组织对外源物质正常的代谢，加剧抗生素药物或有毒物质在生物体中的累积.

5 总结

现阶段研究人员探究NFLX对CYP450酶系的影响主要有以下表现：在微观水平，研究对象由酶层面(蛋白质)到转录层面(mRNA)再到基因层面(DNA)；在宏观水平，从实验生物的生长发育到各个系统组织生物活性再到不同器官的生理状态已经做了比较全面和细致的工作.研究表明，NFLX对于水生生物体内CYP450酶系的影响可以从2个方面来实现：一方面是在CYP450酶发生作用的效应阶段，即Ⅰ相代谢中，直接影响氧化代谢中CYP450酶活性,在长期的作用下，NFLX通过抑制CYP450酶在生物肝脏、肾脏和肌肉等组织的活性，削弱了生物体代谢及排泄有毒物质的能力，更容易造成有毒物质在生物体中的积累；另一方面，NFLX在cyp450基因的转录水平发挥调节作用，对DNA转录出的mRNA的量有所影响，通过干扰mRNA的量来影响翻译的CYP450酶的量，进而影响CYP450酶系酶的总活性，最后使得生物体代谢有毒物质的能力发生变化，影响生物整体的生长、发育和繁殖.宏观上，这种影响作用经过生物链不断的累积和放大，最终对整个生态系统造成潜在的危害.

CYP450酶系组织结构庞大，涉及多种不同的生化过程，同时生物体内存在其同工酶，这种机制会缓冲NFLX对于生物的毒性作用.现阶段的研究多集中于CYP450酶系在药理学免疫调节活性中的关键作用，而对于作为毒性物质的指示指标，相关研究还不够系统和完善，毒性物质的浓度和各个酶之间的对应关系还不够明确和清晰，不足以单独作为一种指标来衡量毒性物质对于生物的毒害作用.随着人们对抗生素污染的不断重视和相关针对性的研究进一步深入，相关的数据变化进一步对应和量化，此后CYP450酶系可以作为一种更加快速准确反应毒性损伤的指标，用来直观地表现NFLX等抗生素对于生物的毒害作用.