花椒碳点荧光探针的制备及对牛奶中溴代乙酰胆碱的检测

李志英，段亚琴，张慧，雷嘉昕

(忻州师范学院 化学系，山西 忻州 034000)

碳量子点(CDs)是近几年新发展起来的一种新型的碳纳米材料，是荧光碳纳米材料中最重要的一种，也称为碳纳米点、碳纳米晶和碳点[1]，是尺寸在 10 nm 以下、单分散、几何形状近乎球型的碳纳米功能材料.相对于传统的半导体量子点与有机染料，CDs粒径小，水溶性好，化学惰性高，易于功能化，耐光漂白，低毒性，并且具有良好的生物相容性[2].正是因为CDs的这些优越的性质，所以在生物以及药物领域中的应用才越来越广泛[3-4].

溴代乙酰胆碱(ACH)是一种化学物质，在神经系统中担当信使[5]，与睡眠、运动、学习记忆有着密不可分的联系，广泛分布于中枢神经系统，对ACH的测定，常采用电化学检测法[6-7]，此外还有放射免疫法、荧光分光光度法、高效液相色谱法和离子选择性微电极法等[8].本实验以食用花椒制备的CDs为荧光探针，考察了不同条件下ACH对CDs荧光的增强作用，这种方法操作简单，结果准确，稳定性好，可用于制备快速检测生物体内ACH的传感器.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

电热恒温鼓风干燥箱(上海捷呈实验仪器有限公司)；岛津UV2550紫外可见光谱仪(岛津公司，苏州)；岛津RF-5301PC荧光分光光度计(日本岛津有限责任公司)；Tecnai G2 F205-TWIN透射电子显微镜(美国FEI公司)

溴代乙酰胆碱(ACH)溶液(上海抚生实业有限公司)：准确称取 0.022 6 g的ACH固体，用少量蒸馏水溶解，定容到100 mL的容量瓶中，得1×10-3mol/L的溶液备用；硫酸奎宁(上海跃腾生物科技发展有限公司)：称取0.04 g硫酸奎宁于100 mL干燥的烧杯中，用0.050 mol/L硫酸溶解，定容至100 mL容量瓶得1×10-3mol/L硫酸奎宁以备用.牛奶、酸奶原液(蒙牛纯牛奶，北京通州食品工业区)，花椒(购于忻州市华美超市)，实验所用其他试剂为分析纯，水为二次蒸馏水.

1.2 实验方法

1.2.1 CDs的制备

准确称取0.1 g研磨后的食用花椒粉放入坩埚中，然后控制烘箱温度在200 ℃，加热20 min，冷却后用1 mol/L的NaOH溶液溶解，用蒸馏水定容至100 mL.

1.2.2 CDs的表征

将CDs溶液干燥后，用Tecnai G2 F205-TWIN透射电子显微镜进行检测.取制备好的CDs溶液 0.3 mL定容于25 mL比色管中.设定狭缝宽度为10 nm，荧光比色皿厚度为1 cm,于λex、λem分别为315、429 nm处测定荧光光谱.并以蒸馏水为空白对照，在200～400 nm下测定紫外光谱.

1.2.3 CDs荧光量子产率的计算[9]

取2支25 mL的比色管，1支加入0.3 mL CDs，另1只加入1×10-7mol/L的硫酸奎宁1 mL，定容，以蒸馏水为空白，利用紫外光谱仪，在波长320 nm下测定溶液的吸光度.然后调整荧光光谱仪狭缝宽度为10 nm，荧光比色皿厚度1 cm,于λex、λem分别为315、429 nm处分别测定溶液的荧光光谱.

所获各参数代入量子产率公式中进行荧光产率的计算，计算公式为

Yu=Ys×Fu/Fs×As/Au.

Yu——待测未知样品的量子产率；Ys——标准物质的荧光量子产率；Fu、Fs——待测样、标准物稀释液的积分荧光强度；As、Au——标准物、待测样在激发波长处最大吸光度值.

1.2.4 CDs对ACH的检测

取2支10 mL比色管，分别加入制备好的CDs 1 mL，β-环糊精(β-CD)溶液1 mL，其中1支试管加入适量一定浓度的ACH，加蒸馏水稀释至10 mL，狭缝宽度10 nm，λex/λem=315/429 nm，利用荧光分光光度计测定CDs的荧光强度F0以及加入ACH体系的荧光强度F，并计算ΔF(ΔF=F-F0)值.

2 结果与讨论

2.1 CDs的表征

用普通微栅支持膜浸渍在CDs溶液中，放在红灯下烘干后扫描CDs直径的大小.分别配制1×10-4mol/L的ACH、CDs和CDs+ACH溶液，利用紫外可见光谱仪，石英比色皿厚度1 cm,在200～400 nm测定紫外吸收光谱.用荧光分光光度计，将狭缝宽度设为10 nm，在激发波长为315 nm和发射波长为429 nm处测定荧光光谱.

图1可以看出制备的CDs为球形，粒径大小为2～10 nm，碳点平均直径为4.2 nm.从图2中可以看出CDs和ACH在260 nm处没有紫外吸收，二者混合后有紫外吸收，由图3可知，ACH没有荧光，CDs中加入ACH，体系的荧光会增强，表明ACH对CDs荧光具有增敏作用.

图1 透视电子显微镜图Fig.1 TEM images of CDs

图2 ACH和CDs作用的紫外吸收光谱Fig.2 UV spectra of interaction of ACH and CDs

图3 ACH和CDs作用的荧光光谱Fig.3 Fluorescence spectra of interaction of ACH and CDs

2.2 制备温度和时间的选择

称取0.1 g食用花椒粉5份，置于烘箱中，将温度分别控制在180、190、200、210、220 ℃，加热20 min，冷却后用1 mol/L的NaOH溶液溶解，用蒸馏水稀释定容至100 mL.控制时间分别为5、10、15、20和25 min，按1.2.1的方法测定发射波长为429 nm时CDs荧光强度F0，确定CDs的制备温度和时间，结果见图4、5.

图4 烧灼温度对CDs荧光的影响Fig.4 Effect of cautery temperature on fluorescence of CDs

图5 烧灼时间对CDs荧光的影响Fig.5 Effect of time of cautery on fluorescence of CDs

从图4中可以看出，在200 ℃时，CDs的荧光强度最大，因此，200 ℃为CDs制备的最佳温度.从图5中可以看出，在200 ℃下加热20 min时，荧光强度最大，所以20 min为最佳制备时间.

2.3 pH值和放置时间及修饰剂对量子点荧光强度的影响

取5支10 mL的比色管，分别依次加入制备好的CDs 和β-CD溶液各0.1 mL，加蒸馏水稀释至10 mL，分别考察放置时间及修饰剂和pH值对CDs荧光强度的影响，结果见图6、7.

图6 pH值对CDs稳定性的影响Fig.6 Effect of pH on the fluorescence intensity of CDs

图7 时间对CDs稳定性的影响Fig.7 Effect of placement time on the fluorescence intensity of CDs

由图6可知，pH值为4～7时，CDs的荧光强度逐渐增强.原因可能是酸性条件下β-CD水解，保护作用减弱，荧光猝灭，且从数据可以看出pH在偏酸性时对体系影响较大，因此CDs的最佳pH值为7.从图7可知，加入β-CD溶液0.1 mL后，放置时间对CDs的荧光强度的影响不大，比较稳定.

2.4 CDs荧光量子产率的测定.

按1.2.3的方法测定，将测定的各参数代入量子产率计算公式，计算CDs荧光量子产率，计算结果见表1.

表1 荧光碳点的量子产率

2.5 CDs和不同物质的响应

图8 CDs对不同物质的响应Fig.8 Response of CDs to different compounds

取13支10 mL的比色管，均加入CDs原液0.1 mL，除1号管外，其他各管加入1 mL，1×10-4mol/L各响应物质溶液(ACH,丙二醇，盐酸普鲁卡因，三聚氰胺，甲醛，赖氨酸，牛血清蛋白，水杨酸，对苯二胺，氯霉素，亚硝酸盐，1-萘乙酸)，加蒸馏水稀释至10 mL，室温下反应5 min，摇匀.将荧光分光光度计狭缝宽度设为10 nm，在λex/λem=315/429 nm处测定荧光强度.结果如图8所示.由图8可知，F/F0的巨大差异表明CDs对ACH具有良好选择性.

2.6 测定体系的pH值和反应时间的选择

取5支10 mL的比色管，5支比色管中分别加入制备好的CDs 0.1 mL，将pH值调为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，再分别依次加入1×10-3mol/L ACH 1 mL，定容，测定CDs 以及反应体系的荧光强度F，试剂空白(未添加ACH)荧光强度为F0，计算ΔF(ΔF=F-F0)值.结果如图9.同条件下测定反应时间分别为5、10、15、20、25 min时的ΔF，结果见图10.

图10 反应时间对荧光光谱的影响Fig.10 Effect of reaction time on fluorescence spectra

实验表明，调节pH值为7时，ΔF最大，从数据可以看出，pH偏酸性时对体系影响较大，而混合液本身的pH值为7，所以本实验选择不加缓冲溶液.反应时间为5 min ΔF最大，在20 min内基本不变，体系比较稳定.

2.7 工作曲线及检出限

取10 mL的比色管，分别依次加入1×10-5mol/L ACH 0 、 0.08、0.2、0.3、0.8、1.0、1.1 、1.2、1.3 、1.4 、1.6 、1.7 mL，再加入CDs 和β-CD溶液各0.1 mL，定容至10 mL，反应5 min后，测定各溶液的荧光强度F0和F，并计算ΔF(ΔF=F-F0).结果见图11、12.取11支10 mL的比色管，依次加入制备好的CDs 0.1 mL，加蒸馏水稀释至10 mL，测定荧光强度F，求得其标准偏差(σ)为1.75×10-6mol/L，相对标准偏差为0.37%，利用3σ/K公式求得检出限为1.62×10-8mol/L.

图11 ACH与CDs作用的荧光光谱Fig.11 Fluorescence spectra of CDs with ACH

图12 ACH 和 ΔF的工作曲线Fig.12 Work curve of ACH and ΔF

实验结果表明，当ACH浓度在0.08～1.6 μmol/L时与ΔF呈良好的线性关系.绘制工作曲线，其线性回归方程为ΔF=314.72c+134.54，r=0.997 9.

2.8 干扰离子的测定

2.9 样品测定

量取5 mL牛奶于25 mL比色管中，加入8 mL的乙腈溶液，震荡混匀后用超声波提取，设定温度60 ℃，功率为280 W，时间为20 min，抽滤后转移到25 mL离心管中，常温下沉降蛋白质10 min，以1 000 r/min高速离心5 min.平行3次实验，并计算相对标准偏差和回收率，结果见表2.

表2 样品的测定及回收率

3 结论

实验用花椒为碳源制备了CDs，并探讨了制备CDs的最佳条件，以及考察了pH值和时间对CDs稳定性的影响.建立了CDs检测乙酰胆碱的新方法，该方法操作简便，无毒无害，并且检出限低.在最佳条件下，该方法的线性为0.08～1.6 μmol/L，线性方程为ΔF=314.72c+134.54,相关系数r=0.997 9，检出限(3σ/K)为1.62×10-8mol/L，并对样品进行了测定，回收率为98%～102%.