紫色红曲霉的微波诱变及其产红曲色素发酵条件的优化

武金霞，王琰，谭政浩，刘爽，隋思强 ，张贺迎

(1.河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002；2.河北大学 生物技术研究中心，河北 保定 071002)

紫色红曲霉(Monascuspurpureus)属于真菌界Fung，子囊菌门Ascomycota，散囊菌纲Eurotiomycetes，曲霉目Eurotiales，曲霉科Aspergillaceae，红曲霉属(Monascus)[1].红曲是红曲霉属菌株发酵大米制成，为药食两用传统中药[2]，红曲色素是由红曲霉属菌株产生的聚酮类混合物[3-5]，主要分为红、橙、黄3大类，并且色素之间会随着pH值的变化发生可逆性转换[6-7]，耐热性较强，熔点为160～190 ℃[8].红曲色素作为天然色素，其传统应用多为染色[9-10]，尤其是食品着色[11]，但越来越多的文献报道红曲色素具有多种生物活性[12]，如抑菌[13]、抗氧化[14]、降血脂[15]以及抑制癌细胞增殖、促使其凋亡等[16].因此，高产红曲色素的红曲霉菌株选育及发酵研究具有重要意义，是进一步开发红曲色素的基础.

本研究以微波诱变紫色红曲霉S1(Monascuspurpureus)，筛选高产红曲色素的突变株，通过优化固态发酵条件大大提高了其产红曲色素的水平.

1 材料与仪器

1.1 菌种

紫色红曲霉S1 (Monascuspurpureus)，本实验室保存.

1.2 培养基

大米豆粕斜面及平板培养基：大米 70 g、豆粕 30 g 于500 mL 水中煮0.5 h，沥出液体加水至500 mL，添加琼脂使其质量分数为2%，pH 5～6.

种子培养基：大米粉4 g，蛋白胨6 g，硫酸镁0.4 g，磷酸氢二钾0.3 g，蒸馏水100 mL.

色素发酵基础培养基：大米 20 g 装入 250 mL 三角瓶中，加水24 mL，封口，于121 ℃灭菌20 min.

1.3 实验仪器

HWS恒温智能培养箱(宁波东南仪器有限公司)；722 型分光光度计(上海第三分析仪器厂)；数显恒温水浴锅 HH-4(金坛市杰瑞尔电器有限公司)；恒温智能振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司)；微波炉；细胞计数器.

2 实验方法

2.1 微波诱变

将紫色红曲霉S1在斜面培养基上培养至长满孢子，以无菌生理盐水制备孢子悬液，稀释至105～106个/mL，分装至无菌试管中，装液量5 mL，于微波炉(输出功率700 W)中进行诱变处理0、40、80、120、160、200 s，每处理5 s将试管取出，冰浴去除热效应，诱变时间为微波处理的累加时间.以处理0 s的孢子悬液为对照组，涂布平板培养后计算致死率.

2.2 菌株的初筛与复筛

将培养3 d后平板上长出的菌落每4个点接于同一平板上培养，比较平板上菌落的生长情况，从中挑选色素圈较大，且颜色较深的菌落，转接斜面培养，纯化.

将初筛菌株接种于种子培养基，32 ℃摇床培养 3 d后，以 5%接种量接种于色素发酵培养基培养 12 d，依据 GB4926—2008测量红曲色素值(以每g干基多少个U表示，即U/g)，比较不同红曲霉菌株的产红曲色素能力.

2.3 红曲霉突变菌株的遗传稳定性实验

将复筛得到的突变菌株连续传代 5代，考查其产色素能力是否稳定.

2.4 不同基质对发酵的影响

将紫色红曲霉S1-29分别接种于粳米、香米、糯米为发酵基质的色素发酵培养基，在32 ℃下发酵 12 d，测量红曲色素值，比较其在不同发酵基质上的产红曲色素能力.

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2.5 单因素实验

2.5.1 碳源对紫色红曲霉S1-29发酵产红曲色素的影响

在色素发酵基础培养基中分别添加葡萄糖(质量分数为1%、2%、3%、4%、5%)和甘油(质量分数为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%0.5%)，pH自然，32 ℃下恒温培养12 d.

2.5.2 氮源对紫色红曲霉S1-29发酵产红曲色素的影响

在色素发酵基础培养基中分别添加酵母粉、蛋白胨(质量分数分别为1%、2%、3%、4%、5%)和氯化铵(质量分数分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)，pH自然，32 ℃下恒温培养12 d.

2.5.3 无机盐对紫色红曲霉S1-29发酵产红曲色素的影响

在色素发酵基础培养基中分别添加硫酸镁、磷酸氢二钾、硫酸锌，使其质量分数分别为0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，pH自然，32 ℃下恒温培养12 d.

2.6 正交实验

根据以上单因素实验结果，在基础培养基中添加葡萄糖、蛋白胨、硫酸镁、磷酸氢二钾(A、B、C、D)，设计4因素3水平正交实验，确定不同添加物的最佳复合配比.

3 结果与分析

3.1 紫色红曲霉S1孢子的微波诱变时间的选择

图1 不同微波诱变时间对紫色红曲霉S1孢子的致死率Fig.1 Fatality rate of Monascus purpureus S1 spores in different time of microwave mutagenesis

3.2 微波诱变菌株的筛选

紫色红曲霉S1经紫外线照射200 s后共得菌株1 000株，挑取其中长势较好的199株点接于平板培养基，培养7 d，从中挑取9个菌落大、色素圈大的突变株.9个突变株复筛红曲色素值结果见表1.

表1 9株紫色红曲霉突变株的红曲色素值

由表1可见，紫色红曲霉突变株S1-29和S1-192产红曲色素值较高，较出发株分别提高57.3%和56.3%.后续研究以紫色红曲霉S1-29为实验对象.

3.3 紫色红曲霉S1-29的遗传稳定性实验

将紫色红曲霉S1-29连续传代5代，每传1代都进行产色素发酵实验，红曲色素值分别是3 250、3 260、3 160、3 170、3 140 U/g，平均值(3196±55.05)U/g，表明该菌株有较好的遗传稳定性.

3.4 紫色红曲霉S1-29在不同基质中的产红曲色素能力

不同种类的米营养成分差别较大，主要区别在于直链淀粉和支链淀粉含量不同，实验结果(表2)表明，紫色红曲霉 S1-29 在粳米基质中产色素能力最强.

表2 紫色红曲霉S1-29在不同基质中的产红曲色素能力

3.5 单因素实验结果

3.5.1 添加不同碳源对紫色红曲霉S1-29产红曲色素的影响

以粳米基质培养紫色红曲霉S1-29时，需发酵12 d红曲色素值才能达到最大值.添加葡萄糖和甘油可缩短其发酵周期到11 d.添加葡萄糖质量分数为4%时，其红曲色素值达到3 360 U/g，添加葡萄糖质量分数为5%时， 红曲色素值有所提高，但差异不显著.添加甘油质量分数为0.4%时产红曲色素值最高，达3 310 U/g，继续增加甘油添加量，红曲色素值反而降低.结果见图2.

A.葡萄糖；B.甘油.

3.5.2 添加不同氮源对紫色红曲霉S1-29产红曲色素的影响

添加不同质量分数的蛋白胨、酵母粉、氯化铵对紫色红曲霉S1-29的发酵周期没有影响，但均能提高其产红曲色素水平，其中添加5%蛋白胨时紫色红曲霉S1-29产色素能力最大，红曲色素值可达3 453 U/g，其次为3%的酵母粉(3 356 U/g)以及0.3%的氯化铵(3 322 U/g).结果提示有机氮源对其产红曲色素具有较大的促进作用，见图3.

A.氯化铵；B.酵母粉；C.蛋白胨. 发酵12 d与发酵11 d比较： a.差异极显著(P<0.01);b.差异显著(P<0.05).

3.5.3 添加不同无机盐对紫色红曲霉S1-29产红曲色素的影响

图4结果显示，基质中添加硫酸镁和磷酸氢二钾质量分数分别为0.4%时，紫色红曲霉S1-29产红曲色素的能力极显著提高，红曲色素值可分别达3 408 U/g和3 360 U/g，添加硫酸锌能小幅提高色素产量，添加量影响不显著(图略).

A.硫酸镁；B.磷酸氢二钾. 发酵12 d与发酵11 d比较： a.差异极显著(P<0.01);b.差异显著(P<0.05);c.差异不显著.

3.6 正交实验结果

依据单因素实验结果，选择对紫色红曲霉S1-29产红曲色素提高较明显的4个因素做正交实验，结果见表3.

表3 正交实验结果与分析

由直观分析可知，对于产红曲色素的影响大小是B>A>C>D，氮源对产红曲色素影响最大.确定紫色红曲霉S1-29固态发酵的添加物最佳配比为A2B3C1D1，即葡萄糖、蛋白胨、硫酸镁和磷酸氢二钾添加量(质量分数)分别为4%、6%、0.4%和0.3%.为考察上述发酵条件的稳定性，按该实验条件实验3次，分别测得紫色红曲霉S1-29发酵产红曲色素值为4 006、4 013和3 991U/g，平均值(4 003.33±11.24)U/g，说明该条件稳定可行.

4 讨论

近年来红曲色素越来越多的生物学活性被发现，如何提高红曲霉产红曲色素的水平也成为研究的热点.邓加聪等[17]研究发现添加一定量硫酸亚铁和维生素B1能提高发酵红曲色素值，液态摇瓶发酵时红曲色素值可达714.80U/mL.Agboyibor等[18]发现在偏酸性初始pH5.0条件下，以含有10g/L蛋白胨和1.5g/L丙酮酸的培养基发酵，红曲黄色素和红色素可达(574.76±6.18)U/mL和(570.98±7.66)U/mL.Patrovsky等[19]发现pH2.5添加8.8g/L蛋白胨可以提高红曲色素的黄色素和橙色素产量，两者之和达1 138mg/L.童爱均等[20]通过响应面优化在添加果糖(质量分数，下同)0.54%、氯化铵0.06%和初始含水量46.00%时固态发酵得到红曲红、橙、黄3种色素之和为6 684.16U/g.

通过红曲霉育种也能较大幅度地提高红曲色素产量，如常聪等[21]采用紫外-氯化锂复合诱变方法诱变育种得到红曲霉菌株QH12，其红曲红色素值达到2 450U/g.Liu等[22]利用等离子体诱变技术得到紫色红曲霉菌株M183，固态发酵红曲色素值达8 460U/g.本研究将微波诱变与固态发酵条件优化相结合，紫色红曲霉S1-29产红曲色素值平均达4 003U/g.

目前大规模的红曲霉发酵还是以液态发酵为主.目前市场上还没有自动化控制程度较高的固态发酵装置，无论实验室规模，还是生产规模，多采用筛框进行分批固态发酵，劳动强度大，生产效率低.与液态发酵相比，固态发酵具有无废水排放、无污染的优点，因此研究红曲霉大规模固态发酵工艺，如发酵装置的改进及其自动化控制、通风通氧条件优化等，对于提升红曲色素及其他固态发酵产物的生产水平具有重要意义.