从网络药理学探讨洋金花治疗类风湿关节炎的作用机制

付长龙，梅阳阳，李西海，邱志伟，4，陈长兴，郑春松

1 福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州350122；2 福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州350122；3 福建卫生职业技术学院，福建 福州350101；4 福建中医药大学附属康复医院，福建 福州350003

* 通信作者：陈长兴，E-mail: 1125452554@qq.com

类风湿关节炎是一类以滑膜炎、关节进行性破坏为主要病理基础的慢性自身免疫性疾病，具有易反复、病程长、高致残率等特点，其受累关节常伴有疼痛、肿胀、功能障碍甚至畸形，严重影响类风湿关节炎患者的健康及生活质量［1-2］。类风湿关节炎归属于中医“痹症”范畴，基本病机为本虚标实，即以肺、脾、肾3 个脏腑功能减弱为本，风、寒、湿等外邪及痰浊致气滞血瘀，引起经络痹阻为标实［3-4］。

洋金花又名闹洋花、醉心花、凤茄花、风茄花、白花曼陀罗，其味辛性温，具有行痹通络、止痛镇静之效，可用于治疗风湿痹痛、跌打损伤及慢惊风之痉挛抽搐等，是临床治疗类风湿关节炎常用药物之一。 《本草纲目》记载：“诸风及寒湿脚气，煎汤洗之，又主惊痫及脱肛，并入麻药”，2015 年版《中国药典》亦刊载其具有重要的药用价值。 随着现代医学的深入发展，洋金花及其提取成分已被药学、基础医学及临床应用等领域专家广泛研究，并成为新的研究热点。 研究表明，洋金花具有调节免疫、抗炎、抑制增殖等功能［5］，其多种活性成分可有效治疗类风湿关节炎，减轻类风湿关节炎的滑膜炎症反应，调节免疫应答，阻止其病理进程进一步发展。 此外，洋金花临床治疗类风湿关节炎具有独特疗效［6-7］。本研究通过网络药理学方法，构建洋金花作用于类风湿关节炎靶点的网络模型和“疾病-药物-成分-靶点”网络，筛选与分析网络中的核心靶点以及相应的功能富集和信号通路，为阐明洋金花治疗类风湿关节炎的作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 数据库和软件

数据库和软件具体应用情况，见表1。

表1 数据库与软件汇集Table 1 Collections of database and software

1.2 洋金花有效化合物及靶点筛选

通过中药系统药理学数据库和分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP），检索与洋金花相关的所有化学成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（drug likeness，DL）≥0.18 作为筛选指标，筛选出洋金花的有效化合物，通过Uniprot 数据库将有效化合物的所有蛋白名称转化为基因名。

1.3 类风湿关节炎靶点的获取

通过GeneCards 数据库和OMIM 数据库中的Gene map 以“rheumatoid arthritis”为关键词进行已知的类风湿关节炎靶点检索。

1.4 疾病-药物-有效化合物-靶点网络的构建

用R 3.6.3 的韦恩图（Venn Diagram）包将洋金花靶点和类风湿关节炎靶点取交集并作韦恩图，作为洋金花治疗类风湿关节炎的预测靶基因，利用网络图编辑软件Cytoscape 3.7.1 对获取的预测靶基因和洋金花有效化合物进行可视化处理，构建疾病-药物-有效化合物-靶点网络。

1.5 蛋白质相互作用网络构建

STRING 数据库是一个在线搜索已知蛋白相互作用关系的数据库，本研究采用STRING 7.8 数据库构建预测靶基因的蛋白相互作用网络，去除游离节点，为提高可信度，置信度设置为0.9，建立蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction network，PPI）。 将获得的网络导入Cytoscape 3.7.1 进行可视化处理，用cytoHubba 插件获取度值（degree）最高的30 个基因作为核心基因，度值可以反映网络中某个节点与其他节点相连接的数目，度值越高的节点更倾向于是网络中的核心基因。

1.6 GO 功能富集分析和KEGG 信号通路分析

利用R 3.6.3 ClusterProfiler 包对洋金花治疗类风湿关节炎的预测靶基因进行GO 功能富集分析和KEGG 信号通路分析， 获得洋金花治疗类风湿关节炎的主要功能富集信息和信号通路。

2 结 果

2.1 洋金花有效化合物和作用靶点

在TCMSP 中共检测到洋金花有效化合物27 个，对应的靶基因318 个，主要化合物包括槲皮素、山柰酚、东莨菪碱、白曼陀罗素、阿托品等。 见表2。

2.2 类风湿关节炎靶点

在GeneCards 数据库和OMIM 数据库中共检索到类风湿关节炎相关靶点4 360 个。

2.3 疾病-药物-有效化合物-靶点网络

用Venn Diagram 包共筛选出洋金花治疗类风湿关节炎的预测靶基因125 个，见图1。将预测靶基因和有效化合物导入Cytoscape 3.7.1 进行可视化处理，见图2。该网络共有142 个节点，352 条边。网络中包含27 个有效化合物，槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、阿托品（scopolamine）、异落叶松脂素［（2R，3R，4S）-4-（4-hydroxy-3-methoxy-phenyl）-7-methoxy-2，3-dimethylol-tetralin-6-ol］、天仙子碱（apohyoscine）、东莨菪碱（hyoscine），分别为104、37、11、11、10。 提示以上关联性较强的化合物可能是洋金花治疗类风湿关节炎的重要组成。

表2 洋金花活性化合物Table 2 Active compounds of hindu datura

2.4 洋金花治疗类风湿关节炎预测靶基因的PPI网络

125 个靶点基因基于STRING 数据库的PPI 网络，隐藏游离节点，置信度0.9，见图3。 该网络共有125 个节点，452 条边，平均度值7.23。 每个节点代表一个靶基因， 边代表节点之间的相互作用关系，边越多说明该节点在网络中越重要。 将该网络导入Cytoscape 进行可视化处理，利用cytoHubba 插件获得度值最高的30 个基因作为核心基因，见图4。 由图可见，Ju-Nana 原癌基因（JUN）、蛋白激酶Bα（PKBα或AKT1）、V-rel 网状内皮细胞过多症病毒原癌基因同源物A（RELA）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）度值（degree 依次为：30、29、28、27）明显高于其余靶点度值（degree均＜22），这提示以上靶点在PPI网络中发挥了重要的关联作用，可能是洋金花与类风湿关节炎产生关联的关键作用靶点。

2.5 基因本体功能富集分析

图1 洋金花靶点与类风湿关节炎靶点韦恩图Figure 1 Venn diagram of the hindu datura target and rheumatoid arthritis target

图2 类风湿关节炎-洋金花-预测靶点-有效化合物网络Figure 2 Network of rheumatoid arthritis-hindu daturapredicted target-effective compound

图3 预测靶基因构建的PPI 网络Figure 3 Prediction of PPI network constructed by target genes

基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析包括生物学过程（biological process，BP）、细胞组分（cell component，CC）和分子功能（molecular functions，MF），见图5。利用R 3.6.3 的ClusterProfiler 包对125 个预测靶基因进行分析，GO 分析中涉及2 313 个条目，包括BP 2 086 条、CC 75 条、MF 152条。 洋金花治疗类风湿关节炎的预测靶基因BP 主要涉及脂多糖反应、细菌源性分子的反应、对活性氧的反应、对金属离子反应、氧化应激反应、类固醇激素反应、活性氧代谢过程、对氧含量的反应等。CC包括膜筏、膜区、质膜筏、突触前膜的组成部分。 MF涉及到核受体的活性、转录因子活性（直接配体调控序列特异性DNA 结合）、类固醇激素受体活性、细胞因子受体结合、细胞因子活性、DNA 结合转录激活剂活性、RNA 聚合酶Ⅱ转录因子结合、 激酶调节活动、受体配体活动等。

图4 PPI 网络中的核心基因Figure 4 Core genes in the PPI network

2.6 京都基因和基因组百科全书信号通路分析

利用R 3.6.3 的ClusterProfiler 包，对洋金花治疗类风湿关节炎的预测靶基因进行京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信号通路分析，前20 结果，见表3。 主要涉及AGE-RAGE 信号通路、IL-17 信号通路、TNF 信号通路、HIF-1 信号通路和Toll 样受体信号等关键通路。

3 讨 论

洋金花在中国古代已被应用于疾病治疗。 据《后汉书·华佗传》记载，古代医家华佗开展“刳破腹背，抽割积聚”以及“刮骨疗毒”等外科手术，与其所创“能令人麻醉，忽而不知人事，任人劈剖，不晓痛痒”的麻沸散密切相关［8］；清代《伤科汇纂》卷七方名的整骨麻药以“闹羊花倍用，胡加子、姜黄、川乌、草乌、麻黄各等分”构成，则具有“开取箭头，服之不痛”之功效［9］，以上组方均以洋金花为主药，充分验证了洋金花具有抗炎、镇痛、抗氧化等作用。 因此，洋金花被广泛应用于治疗风湿痹痛、癫痫、蛇伤、狂犬病等。 在南美洲、欧洲、中东等国外医学中，洋金花也被用于治疗各类疾病，如风湿病、溃疡、伤口、炎症、坐骨神经痛等，故又被称为“万能神药”。 此外，还发现洋金花在改善免疫系统疾病方面（类风湿、银屑病等）也具有良效［10-11］，尤其在干预类风湿性关节炎病程进展方面疗效独特［12］。 这可能与洋金花以下的作用机制有关。

3.1 从网络药理学探讨洋金花治疗类风湿关节炎的作用机制

3.1.1 抗炎镇痛作用 本研究TCMSP 检测到洋金花有效化合物27 个，对应的靶基因318 个，主要化合物包括槲皮素、山柰酚、东莨菪碱等。 有研究表明，槲皮素可降低类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中炎症因子（interleukin，IL）-1β、6、8 与基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-1、3、13 的含量表达，这可能与抑制NF-κB 的表达相关［13］；山柰酚（3，4'，5，7-四羟基黄酮）作为一种具有羟基苯基铬酮结构的次生植物代谢物，可调控炎症反应过程，改善致炎状态［14］；东莨菪碱对大脑皮层及皮下部位产生抑制作用，其可能通过诱导脑电波由低幅快波转变为不规则高波幅慢波，增加脑电总功率和低频成分及其主频率，进而促使意识丧失，产生麻醉止痛功效［15-16］。这提示，洋金花发挥抗炎镇痛作用以治疗类风湿性关节炎可能与以上活性成分物质密切相关。 这与刘振明等［17-18］研究发现洋金花具有很明显的镇痛作用，显著提高小鼠的痛阈值的研究结果一致。

图5 GO 功能富集分析Figure 5 GO functional enrichment analysis

表3 KEGG 信号通路Table 3 KEGG signaling pathway

3.1.2 抗氧化作用 在类风湿关节炎介导的慢性疼痛中，外周敏化发挥了重要作用，而外周致敏机制通常因关节炎症或结构异常损伤直接诱导激活致敏伤害感受器（例如低阈值伤害性纤维），伴随刺激累及，可最终促使脊髓神经元致敏发生［19］。 在此过程中，多类型激素与趋化因子扮演了重要角色，其中异常氧自由基的含量表达可直接介导炎症反应，引起疼痛，进而加剧类风湿关节炎的病理进程。 其具体机制为：以自由电子的形式形成局部负电位，释放电子汇聚成电子流，并趋向高电位的痛觉神经末梢，当电子流刺激达到阈值电位时，Na+、K+通道开放，膜电位翻转，产生了动作电位，引起疼痛［20］。 有研究表明，洋金花甲醇提取物、总生物碱、有效活性成分（槲皮素、山柰酚）等具有较强的抗氧化作用［21-23］，可增加抗氧化剂的表达酶表达，提高血液中超氧化歧化酶的活力，抑制丙二醛含量，降低细胞损伤，从而调节氧化应激反应，介导炎症反应过程。 这提示，洋金花治疗类风湿性关节炎可能与其抗氧化作用有关。

3.2 洋金花通过调控与炎症反应相关信号途径发挥治疗类风湿性关节炎作用

本研究网络药理学分析结果显示，洋金花通过调控与炎症反应相关信号途径发挥治疗类风湿性关节炎作用，其具体作用途径及过程包括：

3.2.1 调节活化阶段 受病理性致炎因素刺激后，炎症因子可与细胞膜受体发生特异性结合，通过跨膜信息递进，诱导胞内丝／苏氨酸蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信号活化。活化后的MAPK 信号可进一步启动级联效应，直至将跨膜信息移至细胞核内，并特异性激活相关转录因子，产生转录效应，进而参与细胞的多种生物学反应。

3.2.2 调节转录阶段 受到压应力异常改变或炎症刺激因素影响，其信息调控从胞外向胞内传递，再到引起生物学效用，需要MAPK 途径的级联反应（三级激酶）的参与。 在此过程中激活型Ras 通过级联反应活化Raf 转录因子，一旦发动该反应后续又可依次激活丝裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MAPKK 或MEK）与细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）（其中ERK2 即MAPK1），而ERK 作为Ras 途径的重要下游部分，是连接胞质至细胞核内信息转录的关键媒介，一旦被磷酸化激活，即转变为p-ERK1／2，可引起下游相关转录因子（C-JUN 等）活化，由此介导炎症反应［24］。

3.2.3 调控效应（致炎）阶段 有研究发现，TNF-α与ERK 信号途径具有密切联系，TNF-α 可产生放大ERK 信号途径的活化效用［25］，此外，IL-1β 可上调细胞中C-MYC 含量表达，并影响C-MYC 等相关信号转录过程［26］。 受磷酸化作用而被活化的p-ERK1／2 可作用于多类活性底物，其中可针对内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitricoxide synthase，eNOS）与诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）并致使其活化，诱导精氨酸发生氧化产生NO，参与氧化应激反应［27］。而AKT1（又称为蛋白激酶B）作为丝／苏氨酸蛋白激酶家族中的重要成员之一，亦参与了多种生物学过程（代谢、增殖、血管生成等）。 研究表明，RELA 基因在调控炎症的细胞信号系统—NF-κB 信号通路中起着极其重要的作用［28］。 而当其遭受外界压力变化、异常细胞因子（脂多糖、TNF-α 与IL-1 等）与自由基（NO 等）作用、紫外线照射影响及细菌或病毒抗原发生结合反应等一系列刺激后，可激活NF-κB 经典途径，而此通路的活化又可加剧炎症反应的程度［29］。 综上，洋金花可能通过调控以上相关信号途径及信号分子发挥作用。

4 小 结

随着计算机技术的普及应用，网络药理学已成为一种研究中药有效成分及其作用机理的新途径。本研究基于网络药理学研究发现洋金花可通过多途径、多靶点发挥抗炎镇痛及抗氧化作用治疗类风湿关节炎；推测其机制可能与槲皮素、山柰酚、东莨菪碱等活性物质有关，并调控相关信号分子及信号途径抑制炎性反应和氧化应激反应。 这可为进一步开展洋金花防治类风湿关节炎作用机制的基础研究提供一定的理论依据［30-31］。

但本研究仍存在一些不足之处，如：①洋金花治疗类风湿关节炎作用途径间的交互影响机制及其是否通过影响关联的非编码长链RNA 或微小RNA等微介质成分的调控机制仍需进一步研究；②洋金花的活性成分（槲皮素、山柰酚、东莨菪碱等）治疗类风湿关节炎的深层次效用机制及有效成分间的联合应用研究亦需要进一步探讨。