羟基喜树碱脂质体的制备及其抗肿瘤效果的评价

陈文忠，庄翌，郝翌，陈家英，腾德义，段晓波，梅胜尧，杜颖,陈宝安

(1.南京绿叶制药有限公司，江苏 南京 210061；2.江苏省药物研究所，江苏 南京 210009；3.东南大学附属中大医院 血液科，江苏 南京 210009)

羟基喜树碱是20世纪60年代从喜树碱中分离得到的一种吲哚生物碱，对人类恶性肿瘤具有广泛的抗肿瘤活性，其机制与选择性抑制拓扑异构酶Ⅰ有关，可干扰DNA复制。由于羟基喜树碱溶解度低、内酯环不稳定以及肿瘤中多药耐药相关蛋白的表达，降低了它的生物利用度，极大地限制了其在靶点的浓度和疗效[1- 3]。喜树碱羟基化衍生物属有效的拓扑异构酶抑制剂[4]，具有更好的抗肿瘤作用、更低的毒性和更宽的抗瘤谱，其活性基团是其母体结构E环上的δ内酯环，它通过作用于拓扑异构酶Ⅰ干扰癌细胞DNA的复制，从而使癌细胞凋亡。但由于羟基喜树碱不溶于水的性质，以及其重要活性基团δ内酯环在血循环中(血液pH约7.4)水解成羧酸型而活性降低[5- 8]，影响临床使用的顺应性及疗效。为进一步开拓羟基喜树碱的抗肿瘤作用，我们从羟基喜树碱的递药系统方面着手研究，将羟基喜树碱制成脂质体，利用小鼠肝癌H22和小鼠肉瘤S180两种实体瘤动物模型，观察了羟基喜树碱脂质体的抑瘤作用。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

羟基喜树碱原料药购自美尔雅(集团)美升药业有限公司，蛋黄卵磷脂购自南京绿叶制药有限公司，胆固醇购自南京新百药业有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯试剂，其他试剂为分析纯；环磷酰胺批号03112721，购自江苏省恒瑞医药股份有限公司。

1.2 动物

昆明种小鼠，体重18～22 g，由南京医科大学实验动物中心提供，合格证号SCXK(苏) 2002—0031。小鼠H22肝癌腹水型和小鼠S180肉瘤腹水型种鼠购自江苏省肿瘤防治研究所。

1.3 羟基喜树碱脂质体的制备

将卵黄卵磷脂、胆固醇、羟基喜树碱溶于适量无水乙醇中，过0.22 μm滤膜除菌，滤液置茄形瓶中旋转蒸发，减压抽干成膜。

将枸橼酸钠、枸橼酸溶于适量5%葡萄糖注射液，使最终溶液pH为5.0，过0.22 μm滤膜除菌，再将此溶液加入到上述茄形瓶中洗膜，洗膜完全后置于热水浴中孵育20 min，再冷却，进行高压均质处理，并经0.22 μm滤膜过滤除菌。按每瓶含2 mg羟基喜树碱进行分装、冻干、压塞、出箱、轧口，即获得羟基喜树碱脂质体。

1.4 羟基喜树碱脂质体理化性质表征

1.4.1 粒径的测定 取羟基喜树碱脂质体适量，以注射用水稀释，用Zetasizer 3000HS 激光粒度分析仪测定其粒径。

1.4.2 包封率及δ内酯环占比的测定 填充Sephadex凝胶柱，并以洗脱介质平衡。取羟基喜树碱脂质体适量，置于填充好的柱体上部，以水为洗脱介质，调整流速为1 ml·min-1，分别收集脂质体部分和游离药部分，并分别测定其含量，计算包封率。测定脂质体中羟基喜树碱的δ内酯环形式含量及羟基喜树碱含量，计算δ内酯环所占比例。

1.4.3 脂质体形态观察 取制备所得脂质体适量，稀释至5～10 μg·ml-1后滴于铜网上，并以1.0%磷钨酸复染，透射电镜观察其形态并拍照。

1.5 羟基喜树碱脂质体对小鼠肉瘤S180 和小鼠肝癌H22实体瘤的影响

1.5.1 荷瘤小鼠模型的建立 分别取H22肝癌腹水型

和小鼠S180肉瘤腹水型种鼠，在无菌条件下抽取腹水，以无菌生理盐水按1∶3稀释，计数并调整浓度，每只小鼠右前肢腋下皮下接种瘤液0.2 ml。

1.5.2 动物分组与给药 在接种后第2天将动物随机分组并开始给药, H22肝癌和S180肉瘤小鼠各分为8组，即空白对照组、环磷酰胺阳性药(30 mg·kg-1)对照组、市售羟基喜树碱注射液3个给药浓度(14、7、3 mg·kg-1)组、羟基喜树碱脂质体3个给药浓度(3、2、1 mg·kg-1)组，每组10只。各给药组每隔1天静脉注射给药1次，共给药3次，空白对照组每隔1天静脉注射生理盐水1次，各组动物静脉注射体积均为0.2 ml·kg-1。实验期间每日称量体重，本实验重复3批。

1.5.3 血液采集与处理 在末次给药后第5天采集各组动物血液，涂片并进行白细胞计数。

1.5.4 测定抑瘤率 在末次给药后第5天处死动物，剥离腋下瘤块并称重，计算抑瘤率。

1.5.5 病理学检测 在H22肝癌小鼠末次给药后第5天处死动物，取出股骨, 剔除肌肉等组织，剪去股骨两端，将骨髓滴在洁净玻片上，用小牛血清将骨髓混匀，均匀推片，制成骨髓片，常规染色并计数。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 羟基喜树碱脂质体粒径

经马尔文粒径仪测定，所制备的羟基喜树碱脂质体平均粒径为357 nm。

2.2 包封率及δ内酯环形式占比

羟基喜树碱脂质体的包封率为94.4%，满足药典对脂质体药物包封率的要求；其δ内酯环形式占总含量的98%以上，表明羟基喜树碱脂质体制剂中δ内酯环未发生降解，活性基团得到了良好的保护，有助于药效的发挥。

2.3 羟基喜树碱脂质体形态

透射电镜照下羟基喜树碱脂质体呈现规整、均一的球形结构(图1)，且尺寸为320 nm，与粒径测定结果一致。

图1 透射电镜下羟基喜树碱的形态 ×16.2万

2.4 羟基喜树碱脂质体对小鼠肝癌H22和肉瘤S180实体瘤的抗肿瘤作用

不同剂量的羟基喜树碱脂质体对H22肝癌显示不同程度的抑制作用，3个剂量组呈明显的剂量效应关系, 与空白对照组比较，羟基喜树碱脂质体抑瘤率为79%～90%(P<0.001)，环磷酰胺抑瘤率平均为85.8%(P<0.001)； 3 mg·kg-1羟基喜树碱脂质体抑瘤率平均为89.5%,3 mg·kg-1市售羟基喜树碱抑瘤率平均为27.5%,二者抑瘤率差异有统计学意义(P<0.001)。见表1。

表1 羟基喜树碱对H22荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

不同剂量的羟基喜树碱脂质体对小鼠S180肉瘤显示不同程度的抑制作用，3个剂量组呈明显的剂量效应关系, 与空白对照组比较，羟基喜树碱脂质体抑瘤率为51%～68%(P<0.001)，环磷酰胺抑瘤率平均为73.6%(P<0.001)； 3 mg·kg-1羟基喜树碱脂质体抑瘤率平均为67.2%,3 mg·kg-1市售羟基喜树碱抑瘤率平均为20.7%,二者抑瘤率差异有统计学意义(P<0.001)。见表2。

表2 羟基喜树碱脂质体对S180荷瘤小鼠瘤体生长的影响

2.5 羟基喜树碱脂质体对小鼠外周血白细胞及骨髓的影响

除市售羟基喜树碱3 mg·kg-1和羟基喜树碱脂质体1 mg·kg-1组白细胞总数未见明显下降，其余剂量组白细胞总数有所下降，与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；羟基喜树碱脂质体及市售羟基喜树碱注射液给药组白细胞数量随着剂量的增加而减少，均呈现剂量相关性。见表3、4。

表3 羟基喜树碱脂质体对H22荷瘤小鼠白细胞总数的影响

表4 羟基喜树碱脂质体对S180荷瘤小鼠白细胞总数的影响

羟基喜树碱脂质体各剂量给药组未见对骨髓细胞有抑制作用，与空白对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。市售羟基喜树碱注射液14 mg·kg-1组中幼红细胞数量与空白对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，7、3 mg·kg-1组未发生明显变化，推测该变化可能与市售羟基喜树碱注射液高剂量用药相关；环磷酰胺给药组多种骨髓细胞(晚幼红细胞、原始粒细胞、中性中幼粒细胞、中性晚幼粒细胞、中性杆状粒细胞)数量发生明显变化，与空白对照组相比，差异有统计学意义(P<0.001)，表明30 mg·kg-1环磷酰胺对小鼠骨髓细胞具有损伤作用。见表5。

表5 羟基喜树碱脂质体对骨髓细胞分类的影响

3 讨 论

国内外已有采取脂质体等制剂手段改善喜树碱类药物稳定性的研究。2000年Tracli等[9]报道了拓扑替康脂质体的研究情况，在小鼠静脉给药后测定小鼠血液中闭环拓扑替康的含量，与拓扑替康水针剂进行比较。他们的研究结果表明：在拓扑替康水针给药5 min后，血液中的拓扑替康只有50%为闭环形式；而拓扑替康脂质体给药4 h后，血液中的拓扑替康仍有95%为闭环形式。该研究证明了将拓扑替康包裹于脂质体中能很好地达到保护δ内酯环的目的。Thomas G Burke等[10]报道喜树碱类新衍生物Lurtotecan以脂质体为载体，在动物试验中可以显著增加抗肿瘤效果，认为脂质体可以稳定喜树碱类的内酯环，比如在PBS缓冲液中3 h Lurtotecan脂质体内酯环>90%，而普通Lurtotecan仅有15%，在人体血液中3 h Lurtotecan脂质体内酯环仍有80%。

在本研究中，我们采用薄膜分散法制备了羟基喜树碱脂质体，其粒径为357 nm，包封率为94.4%，方法简单易行，易于产业化生产。

我们进一步对羟基喜树碱的体内药效和安全性进行了评价，结果表明，羟基喜树碱脂质体对小鼠肝癌H22和小鼠肉瘤S180肿瘤生长有较强的抑制作用，相同剂量下，羟基喜树碱脂质体抑瘤效果为市售羟基喜树碱注射液的3～4倍。羟基喜树碱脂质体显著的抑瘤效果可能与羟基喜树碱的脂质体剂型相关，将羟基喜树碱制备成脂质体后改善了羟基喜树碱的水溶性，优化了体内的药动学行为，使其在体内的半衰期延长，稳定了羟基喜树碱在体内的内酯环结构，同时羟基喜树碱脂质体也更容易进入肿瘤细胞，从而提高了抗肿瘤药效。在H22肝癌小鼠和S180肉瘤小鼠的各给药组(除小剂量组)白细胞总数有所下降，与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；而羟基喜树碱脂质体与市售羟基喜树碱注射液各给药组相比，白细胞总数无明显差异，但两者给药后体内白细胞总数均随着给药剂量的增加而减少，表明血液中白细胞总数的减少与供试品和对照品相关，呈现出剂量相关性；在H22肝癌小鼠中，各剂量给药组均未见对骨髓细胞有抑制作用。本实验结果显示，羟基喜树碱脂质体具有比羟基喜树碱注射液更好的抑瘤效果，同时未增加羟基喜树碱注射液毒性。

传统的治疗恶性肿瘤方式以静脉注射化疗药物为主，但是这种方式的药物选择性相对较差，且毒副作用较大。因此基于药物传递系统进而将药物有效地递送至肿瘤部位，对减轻毒副作用和增强抗肿瘤效果有很大的帮助[11]。长期以来，南京绿叶制药有限公司在研制脂质体新剂型和符合我国国情的脂质体膜材料即高纯度蛋黄卵磷脂方面积累了较为丰富的经验。国外喜树碱类脂质体的研究，大多采用合成磷脂(DPPC、Sphingomyelin、DLPC、DSPC)为膜材料，结合国情，我们采用了资源丰富的鸡蛋黄卵磷脂替代DSPC等合成磷脂，解决了由于羟基喜树碱为水不溶、脂难溶性药物，难以达到较高的包封率的难题。我们研制的羟基喜树碱脂质体包封率达到93%以上，平均粒径在350 nm左右，药效学研究结果达到预期研究目的，羟基喜树碱脂质组合物及其制备方法已申请并获得国家发明专利授权(专利号：ZL200310112772.6)。

综上所述，羟基喜树碱脂质体的研发成功，将使我国特有的重要广谱抗癌药羟基喜树碱资源进一步得到深入的开发，为我国乃至全世界广大肿瘤患者带来福音，使他们获得新生或者延长生命，改善生活质量。