基于焦磷酸测序技术建立基因编辑水稻检测方法

解美霞,王燕,赵新,高越,刘双,陈锐,兰青阔,徐晓辉,曹际娟,王永*

1.天津市农业科学院生物技术研究所, 天津 300381； 2.河北农业大学农学院, 河北 保定 071001;3.河北农业大学食品科技学院, 河北 保定 071001;4.山东省农业科学院， 济南 250100；5.大连民族大学, 辽宁 大连 116600

基因编辑技术主要通过序列特异核酸酶特异切割DNA靶标位点造成双链断裂，诱导DNA损伤修复机制对基因组的定向编辑。基因编辑技术从出现以后就为全球的生物学家提供了一个新的研究思路。目前应用广泛的以Cas9蛋白以及向导 RNA (gRNA)为核心组成的 CRISPR/Cas9 技术，应用于编辑靶标位点过程中，该方法简便且编辑效率高，目前已被广泛应用于多种作物中[1-3]。应用基因编辑技术不仅可以使农作物表现出抗病虫害的优良性状，同时还能使农作物的产量大幅度提升[4-7]。目前这一技术在水稻中已有许多重大进展：如通过基因编辑技术获得产量的增加；通过基因编辑技术对水稻基因进行替换和敲除从而获得抗除草剂以及抗逆的优质水稻新品种[8-10]。

转基因生物自出现以来就备受关注，到目前为止我国已有几种作物被允许进行转基因产品的生产及加工。通过基因编辑技术编辑靶标基因后，生物的全部遗传物质中只有少数基因发生了改变，尤其是一些少量或者单碱基插入缺失造成突变的基因编辑产物，这导致现有的一些转基因检测技术无法用于基因编辑产物的检测。因此目前亟需新的检测技术应对越来越多的基因编辑生物，做好转基因产品的检测工作，为农业的生产与发展提供技术支撑。

焦磷酸测序(pyrosequencing)技术是通过 4 种酶(ATP硫酸化酶、DNA聚合酶、三磷酸腺苷双磷酸酶以及荧光素酶)共同催化反应体系的一种酶级联化学反应。该技术可用于对已知短序列的测序分析，不需要荧光标记引物及电泳检测。相比较其他测序方法，焦磷酸测序技术具有实时检测、分析快速准确等特性[11-12]。目前已成为单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)基因分型、突变检测等的一种有效手段。由于基因编辑产物大多是通过突变、敲除或者插入几个碱基，类似于物种的定向突变，因此利用焦磷酸测序技术检测转基因产品就成为了可能。

本研究利用焦磷酸测序技术检测 CRISPR/Cas9 编辑技术诱导的水稻PL3基因中的靶向突变，以期建立一种基因编辑水稻检测技术，期望本研究能够在现有转基因产品的检测体系中进行提升及补充，从而更好更快的开展转基因检测工作，并为其他基因编辑产物的检测提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试基因编辑型水稻与亲本日本晴(野生型水稻)均由山东省农业科学院基因功能研究团队提供。基因编辑型水稻利用 CRISPR/Cas9 技术在 LOC_Os01g56780 位点诱导插入碱基 A，导致PL3基因功能发生改变。

1.2 试验仪器

Pyro Mark焦磷酸测序仪(Pyro Mark Q96 ID)、普通 PCR 仪(ABI Veriti 96)、凝胶成像仪(Azure C150)、电泳仪(EPS-3000-VII)、高速冷冻离心机(Eppendorf Centrifuge 5810/5810 R)、恒温水浴锅(HH-600)、超微量分光光度计(Nanodrop 1000)。

1.3 试验试剂及配置

植物DNA提取试剂盒(TianGen公司)、DNA Marker(TaKaRa公司)、GelRed 染料、 2×GoTaq Green Master Mix(Promega公司)、乙二酸四乙酸二钠(EDTA·Na2)；三羟甲基氨基甲烷(Tris)；冰乙酸； Binding Buffer(QIAGEN)； Annealing Buffer(QIAGEN)、Washing Buffer、Sepharose beads (Qiagen公司)。

1.4 DNA提取

将野生型水稻和编辑型水稻种子经灭菌处理后种植并放入光照培养箱内进行培养，待生长至3叶期时取植株幼嫩叶片组织。用液氮充分研磨叶片后取100 mg样品粉末置于2 mL离心管中。使用植物 DNA 提取试剂盒提取水稻DNA，经分光光度计测定样品DNA浓度后置于-20 ℃保存备用。

1.5 焦磷酸测序引物设计及有效性检测

使用 PSQ Assay Design 软件设计焦磷酸测序PCR 扩增引物(PL3-Pyro-F、PL3-Pyro-R、测序引物 PL3-Pyro-Seq)，引物由金唯智生物科技有限公司合成(表1)。

表1 焦磷酸测序引物Table 1 Pyrosequencing primer

PCR扩增反应体系参照 Pyro Mark Q96 ID焦磷酸测序仪使用说明书进行设计。将野生型和基因编辑型水稻 DNA作为模板， PCR 扩增反应体系(50 μL)：2×PCR Master Mix 25 μL，PL3-Pyro-F 1 μL，PL3-Pyro-R 1 μL，DNA (25 ng·μL-1)2 μL， ddH2O 21 μL。PCR反应程序设置为：94℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，50次循环；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。待PCR反应程序结束后使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增的 PCR 产物质量，应出现条带清晰且单一的目的条带，在该试验过程中同时加入一个空白样品作为对照。将扩增完成的PCR产物放入4 ℃备用。

1.6 焦磷酸测序基因分型定性检测

为保证本次试验的准确性， Sepharose beads 在使用前要充分混匀，所有试验试剂需提前 15 min放至室温。具体操作步骤如下：①在96孔酶标板中加入47 μL Binding buffer 和3 μL Sepharose beads混匀后分别将电泳结束，剩余产物全部加入相应酶标板中，1 300 r·min-1混匀15 min；②将38.8 μL Annealing buffer 和1.2 μL测序引物加入测序反应板中，混合均匀备用；③酶标板中产物进行单链分离且释放到测序板中，反应结束后将测序板置于金属浴(80°C)反应2 min，冷却后放入Pyro Mark Q96 ID焦磷酸测序仪中进行试验；④选择 SQA系统模式，将酶、底物混合物和4种dNTP(A、T、C、G )依次加入试剂舱，根据分析序列(5′-[A]CAATCCGTTGGCTTCAATTC-TCTTT-3′)和系统自动生成的喷入碱基顺序(5′-GACATCG-3′)设置反应程序进行焦磷酸测序反应。

1.7 焦磷酸测序基因分型定量检测

将基因编辑型和野生型水稻 DNA 模板(25 ng·μL-1)按表2的比例均匀混合成 8 个浓度梯度(S1～S8)，S1～S6 用于绘制不同分型的标准曲线，检测焦磷酸测序定量分析的能力；通过 S7～S8 进行半定量检测分析(盲样)。参照 1.4 和 1.5 的方法步骤进行 PCR 扩增和焦磷酸测序检测试验。

表2 S1～S8焦磷酸测序模板体积比例Table 2 Volume ratio of S1～S8 pyrosequencing template (ng·μL-1)

2 结果与分析

2.1 PL3基因编辑水稻焦磷酸测序引物有效性检测

本研究设计的扩增产物预期长度为129 bp，通过2%琼脂糖凝胶电泳检测所扩增的 PCR 目的片段大小与预期片段长度相一致。焦磷酸测序引物 PCR 扩增完成后(图1)均出现清晰单一的特异性条带，且对照(CK)未出现任何条带。结果表明本试验设计的焦磷酸测序引物有效性好,能够满足此次焦磷酸测序试验要求。

2.2 焦磷酸测序基因分型定性检测结果

通过 Sequence to Analyze、Dispensation order和Pyro Mark 程序获得基因编辑型和野生型的焦磷酸测序结果(图2A)：G碱基(第一位)是试验反应程序中设置的阴性对照，其高度为零，作为此次试验反应程序的阴性质控位点； A 碱基(第二位)为检测靶标位点，根据图2中峰值高度可分为3种类型，分别为 -/- (野生型水稻)、A/A (编辑型水稻)、 A/- (杂合类型)； A 碱基与 C 碱基(第三位)和 T 碱基(第五位)高度相同，而 A 碱基(第四位)和 C 碱基(第六位)高度是其2倍，这些为阳性质控位点。

以野生型水稻和编辑型水稻的 DNA 为模板对目的区域进行 PCR 扩增和焦磷酸测序反应检测，使用系统中的 SNP 模式分析其测序结果发现可自动出现分型为“-/-”和“A/A”。同时在测序结果图中看到所检测的靶标位点序列，在野生型样品中没有 A 碱基(第二位)，而在编辑型水稻样品中检测到该碱基(图2B～C)，表明该技术可以有效区分野生型水稻与PL3基因编辑型水稻样品。

注：M—DL 2000 marker；CK—空白对照；1，2—基因编辑型水稻 PCR扩增产物；3，4—野生型水稻 PCR扩增产物图1 焦磷酸测序引物 PCR 产物扩增电泳图Fig.1 Electrophoretic map of PCR products amplified by pyrosequencing primers

A：焦磷酸测序结果示意图；B：基因编辑型水稻焦磷酸测序结果；C：野生型水稻焦磷酸测序结果图2 PL3基因编辑型水稻和野生型水稻焦磷酸测序结果Fig.2 PL3 gene edited and wild type rice DNA template pyrosequencing results

2.3 焦磷酸测序基因分型定量检测结果

通过 SNP 和等位基因频率量化(allele frequencies quantification，AQ)两种模式可对焦磷酸测序检测结果进行有效检测，并得到等位基因频率和基因分型。本研究将2种水稻 DNA 按浓度梯度进行相应稀释并混匀分析构建了PL3基因编辑水稻的分型标准曲线，对焦磷酸测序的定量分析能力进行验证。结果发现，当基因编辑型水稻模板浓度逐渐上升时，[A]碱基的峰高度会逐渐下降(图 3A )；同时选择系统的 AQ 模式对该测序结果进行定量分析发现，在S1～S6 样品中该位点的 AQ 值会逐渐下降，平均值分别为97%、80%、48%、25%、16%、0；在S7～S8样品中 AQ 值分别为66%、38%。发现 AQ 值与编辑型水稻的 DNA 含量呈线性关系：斜率为 1.007(图3B )。表明该方法可对PL3基因编辑型水稻进行有效的定量检测。

图3 野生型和基因编辑型水稻不同浓度梯度测序结果(A)和标准曲线图(B)Fig.3 Sequencing results (A) and standard curve (B) of wild type and gene editing rice with different concentration gradients

3 讨论

基因编辑技术是一种新兴且较为精确的可对生物体基因组特定目的基因修饰的基因工程技术。 CRISPR/Cas9 技术是目前进展最迅速的基因编辑技术，可对特定的 DNA 进行靶向切割，导致目的基因发生定点突变。 CRISPR/Cas9 技术已在水稻、小麦、玉米三大作物上实现了高效精确的单碱基定点突变[13-15]。目前检测基因编辑位点主要使用 Sanger法测序，但该方法耗时且不适于进行大规模检测，其他关于植物基因组编辑的检测方法主要有 PCR/RE 法、错配切割法、TaqMan 法等，但这些方法操作复杂、要求高且适用性有限，不能广泛应用[16]。

焦磷酸测序是一种酶联级联测序技术，能够对已知短序列的测序分析进行检测。该方法操作简单，可鉴定多种植物的病原微生物和成分。刘洪义等[17]通过焦磷酸测序法进行短序列测序分析，用来鉴定马铃薯感染的PVY株系。金莹等[12]利用焦磷酸测序技术能够有效检测大豆过敏原成分。

在本研究中使用焦磷酸测序技术的两种分析模式进行基因定性和定量检测，发现该研究方法具有极高的准确性，操作简便，效率高，同时可检测大量样品。本研究在基因分型定性试验中对焦磷酸测序结果进行定性分析，发现阴性质控位点未出现峰，且阳性质控位点与系统生成峰高度保持一致；在基因分型定量试验中对该检测结果进行定量分析，发现 AQ 值会随编辑型模板含量的增加而升高。该方法可用来有效区分PL3基因编辑型水稻和野生型水稻。基于焦磷酸测序技术的基因编辑方法有望用于基因编辑产品检测监管。