蛋白质活性计量技术研究进展

王仙霞,武利庆,杨彬,张宁,苏萍,杨屹

1.北京化工大学化学学院， 北京 100029； 2.中国计量科学研究院， 北京 100029

随着生物学理论与方法的不断发展，生命科学经历了从“描述生物学”到“实验生物学”再到“创造生物学”发展的历程，当今的生命科学已经从现象描述逐渐转变到精准定量。生命科学的发展突破了传统的诊断与医药领域，拓展到了农业、食品、环境、能源等众多领域，其检测结果的准确与否关系着大众的健康与安全。

蛋白质计量的主体是蛋白质测量理论、测量标准与测量技术，其终极目的是实现蛋白质特性量值与标称特性检测结果在国际范围内的准确与可比。蛋白质的特性量值指的是由确定蛋白质的特性量的数以及单位、参考程序等形式表示的特性量的大小，如含量、活性等。对于蛋白质特性量值的计量，主要是通过建立蛋白质测量结果的量值溯源传递体系，确保测量结果的准确与可比。蛋白质的标称特性是不以大小进行区分的蛋白质的特性，如序列、结构等。对于蛋白质标称特性的计量，关键是提高测量结果的准确性与可比性。

经过近20年的发展，蛋白质含量计量已经日趋成熟，相继发展了同位素稀释质谱、定量核磁、质量平衡等系列权威计量方法，并研制了相应的蛋白质含量标准物质，初步构建起蛋白质含量量值溯源传递体系[1]。但是，蛋白质含量计量中仅仅考虑了依据蛋白质的一级结构即氨基酸序列形成的“被测量”，但实际上蛋白质是由不同的氨基酸通过酰胺键脱水缩合而成的长链大分子，分子通过盘旋折叠形成复杂的高级结构。蛋白质分子活性和功能的实现不仅仅依赖于其一级氨基酸序列，更为重要的是其形成的高级结构。当一级结构不变而高级结构改变时蛋白质的活性和功能可能丧失。蛋白质含量计量技术是依赖于蛋白质的一级氨基酸序列进行定量，不能反映出具有功能的蛋白质的活性浓度，而在实际应用中，如生物医药或体外诊断中，会更多的考虑蛋白质的活性。因此仅测定蛋白质的含量具有一定的局限性，还必须对具有特定功能的蛋白质活性浓度进行精确测定，这就需要蛋白质活性计量的支撑(图1)。蛋白质的活性一般都由参考方法等进行定义，同一个蛋白根据活性定义的不同，可以具有不同的活性量值。建立各种蛋白质活性的量值源头、研究建立蛋白质活性计量方法并研制相关活性标准物质，成为蛋白质活性计量研究的主要内容。当前，蛋白质活性计量的突破主要集中于酶催化活性浓度计量技术以及免疫亲和活性浓度计量技术，其测量结果可以溯源到SI单位。此外，当蛋白质活性测量结果无法建立到SI单位的溯源途径时，仍然广泛使用参考测量程序或国际标准品来建立量值源头。

图1 蛋白质含量与蛋白质活性浓度定量示意图Fig.1 Quantitative diagram of protein content and protein activity concentration

1 酶催化活性浓度计量技术

酶催化活性简称酶活性(enzyme activity)，是常见的一类蛋白质活性，它是指酶催化特定生化反应的能力，单位可用酶催化活性浓度单位表示，即在特定条件下(25 ℃，或其他最适条件)，单位时间内引起一定量(1 μmol)的底物发生反应的酶量，单位为kat。除了法定计量单位，常用的酶活性浓度单位还有国际单位IU(或U)，它们和SI单位kat之间的换算关系如式(1)。

1 IU = 1 μmol·min-1≈16.67 nkat

(1)

酶催化活性浓度的测定需要严格按照酶催化活性浓度的参考测量程序中定义的方案进行操作以保证量值的准确复现。参考测量程序中往往规定了测量时的底物浓度、pH、反应温度、测量时间、波长、光程等参数，测量过程中所有参数均需要通过标准物质或计量标准，建立起到SI单位的溯源性。酶催化活性浓度的测定多采用分光光度法，测量的方式包括终点法与速率法等。目前，国际临床化学联合会(International Federation of Clinical Chemistry，IFCC) 提出了7个血清酶学参考测量程序并被收录到检验医学溯源联合委员会(Joint Commission on The Traceability of Laboratory Medicine,JCTLM )的参考测量程序数据库中，这7个酶分别是α-淀粉酶、丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、天冬氨酸氨基转移酶、肌酸激酶、γ-谷酰胺转移酶和乳酸脱氢酶，IFCC的这些血清酶学参考测量程序已成为临床酶催化活性浓度测量结果的溯源依据[2-9]。

2 免疫亲和活性浓度计量技术

免疫分析法是利用抗原-抗体间特异性相互作用实现目标物定性定量分析的方法，也是蛋白质常规检测中经常使用的分析方法。由于使用了抗体进行捕获和检测，因此免疫分析法测定的是目标蛋白质中能够与抗体结合的部分，那些由于高级结构改变使得抗原决定簇破坏或被隐藏的蛋白质分子则不能被抗体识别并结合，免疫分析法也就无法测定，因此免疫分析法测定的是目标蛋白分子中能够与抗体结合部分的一个子集，称为免疫亲和活性浓度。蛋白质免疫亲和活性浓度与蛋白质含量的关系如图2所示，其单位与蛋白质含量的单位相同，仍然溯源到SI单位。如果一个蛋白质的免疫亲和活性浓度为ap，相应蛋白质的含量为cp，则存在式(2)。

图2 目标物在偶联有抗体的金箔表面扩散结合与解析的过程Fig.2 The process of diffusion binding and analysis of the target substance on the surface of the gold foil coupled with the antibody

ap≤cp

(2)

当抗体不同时，同一个蛋白质由于识别位点的不同，可能存在多个ap，但是对于给定的抗体(antibaody, Ab)，该免疫亲和活性浓度ap(Ab)是唯一的。为了测定该浓度，近年来发展起来多种免疫亲和活性浓度的绝对测定技术，主要包括基于表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)的无标活性浓度定量(calibration free concentration analysis, CFCA)技术和基于数字ELISA的技术。

2.1 SPR-CFCA技术

CFCA[10-12]是利用已知蛋白质抗原的扩散系数，通过测定在扩散速率部分限制条件下的结合速率直接计算抗原的浓度，该过程如图3 所示。

图3 基于数字PCR的蛋白质免疫亲和活性浓度测定原理Fig.3 Principle of protein immunoaffinity activity concentration determination based on digital PCR

如图3所示，当含有蛋白质抗原的溶液在偶联有抗体的金箔芯片表面以一定速率流过时，溶液中的抗原将扩散到金箔表面，其中只有具有正确的抗原决定簇的抗原分子可以被抗体识别并结合，从而带来SPR信号的改变，因此测定的结果为免疫亲和活性浓度。芯片表面抗原浓度asurface与样品中的抗原浓度abulk之间的关系可用式(3)表示。

(3)

根据质量作用定律，可以得到公式(4)。

(4)

(5)

(6)

式中,D—分析物扩散系数，m2·s-1；F—通过流动池溶液的体积流速，m3·s-1；h,w和l—流动池尺寸(高度、宽度和长度)，m；M—分析物分子量，Da；ηrel—溶剂与水的相对粘度(20 ℃)，无量纲。

由于要求分子间的结合发生在传质扩散限制的条件下，因此限制了CFCA方法分析的分子测量范围，这种方法只能用于分子量大于5 000 Da的蛋白质的分析。

Grover等[13]首次展示了CFCA方法在直接检测患有不同传染病和非传染病患者的血清样品中的生物标志物中的应用。此方法在快速监测血清样品中蛋白质生物标志物丰度、临床诊断和药物发现方面具有非常大的潜力。Karlsson等[14]采用该方法研究了抗体的活性浓度。Su等[15]提出用CFCA法测定G2-EPSPS蛋白的免疫亲和活性浓度，发现活性浓度仅为同位素稀释质谱法测定的蛋白质含量的20%左右；Hu等[16]采用基于SPR的CFCA法对人肌红蛋白的活性浓度进行了绝对定量，发现通过抗体的优化筛选，选择对高级结构不敏感的抗体，测得的蛋白质活性浓度结果与同位素稀释质谱法测量的结果一致。该方法测定过程中不需要任何标准品，测量原理可以用方程清晰地描述，测量结果可以用国际单位制表示，因此该方法有望成为新的蛋白质含量与免疫亲和活性浓度计量的权威方法。

2.2 数字ELISA技术

数字ELISA技术也可获得蛋白质分子免疫亲和活性浓度，目前比较成熟的是借助数字PCR技术建立起数字ELISA的分析方法。数字PCR是一种由Vogelstein和Kinzler于20世纪末提出的核酸分子绝对定量技术。该技术通过将核酸分子稀释到单分子水平后加入到小孔进行扩增反应，扩增完成后测定每个小孔的信号强度，再根据泊松分布原理来确定原样本中核酸浓度的定量技术[17]。数字PCR定量技术不需要建立标准曲线，也不依赖于荧光定量PCR所需要的阈值(Ct值)，是一种无标绝对定量技术，具有较高的稳定性和准确性。采用两条寡聚核苷酸探针标记抗体，通过邻位连接技术(PLA)[18]即可实现蛋白质的荧光实时定量PCR免疫分析，如果将荧光实时定量PCR的扩增体系转移到数字PCR平台上，即可实现蛋白质的免疫亲和活性浓度的绝对定量，测量原理如图4所示[19-20]。

该技术需要使用两个不同的单克隆抗体或一个多克隆抗体来实现，两个抗体分别与抗原蛋白分子的两个不同抗原决定簇结合，因此，采用该方法测定的蛋白质的免疫活性浓度是蛋白质分子中可同时与两个抗体结合的部分，这个与SPR-CFCA技术得到的结果是不一样的。在实验中发现，对于同样的蛋白和抗体，该方法得到的结果远小于SPR-CFCA方法得到的结果，这与理论预测是一致的[21]。

Albayrak等[22]通过结合邻近连接测定(PLA)和数字PCR的非常实用的工作流程，对单个哺乳动物细胞中的蛋白质和mRNA进行了极其灵敏和绝对的定量分析。Hu等[23]报告了一种简单且低成本的基于微芯片的dPCR方法，借助PLA技术，用于定量低浓度蛋白质，方法的线性动态范围达到3～4个数量级，检测限达到飞摩尔级。Christina等[24]利用PCR蛋白定量技术通过检测活性半胱天冬酶-3的含量来检测原代肿瘤细胞中的细胞凋亡。Hu等[21]建立了基于qPCR和dPCR的G2-EPSPS蛋白定量方法，测定了G2-EPSPS在双抗体夹心条件下的免疫亲和活性浓度。

3 其他蛋白质活性计量技术

除了上述可溯源到SI单位的蛋白质活性计量技术外，目前大多数蛋白质活性的量值溯源与传递仍然通过约定的参考测量程序和标准品形成蛋白质活性量值的源头并进行量值的传递，这些约定可以是国际范围内的，也可以是国内范围的，甚至是一个应用领域或一个具体产品范围内的。国际范围内用于体外诊断的参考测量程序可以从国际计量局网站(https://www.bipm.org/)JCTLM参考测量程序数据库内进行查询；约定的国际标准品可以从英国国家生物制品检定所(National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC)网站进行查询。此外，也有根据蛋白质结构与功能活性的相关性，建立蛋白质结构-活性的构效关系建立蛋白质的活性量值，但是该技术仍然在研究探索中，尚未见成熟技术的报道。

4 展望

随着生命科学的进步和生物产业的发展，对蛋白质计量技术的需求将愈发强烈。生物制药、体外诊断等不仅需要蛋白质含量的量值溯源传递体系，更迫切需要建立蛋白质活性量值的溯源传递体系。目前，蛋白质的活性计量技术刚刚起步，绝大多数蛋白质活性量值无法溯源到SI单位，仍然依靠约定的参考测量程序和约定的标准品建立量值源头并开展量值溯源与传递。在可溯源到SI单位的蛋白质活性计量研究中，临床酶催化活性浓度测量是应用最为成功的范例，其量值溯源传递已经形成了国际标准[25]。蛋白质免疫亲和活性浓度的测量已经引起相关研究人员的兴趣，有助于提高蛋白质相互作用的亲和常数与动力学常数的测量准确度[26]。总之，未来在一段时期内，蛋白质活性计量还是要以基础研究为主，逐步建立蛋白质活性测量结果到SI单位的溯源性，进一步验证现有蛋白质活性计量技术并建立新的蛋白质活性计量技术，同时积极探索蛋白质活性量值溯源传递体系在生物产业中的应用。