蛋白质含量计量技术研究进展

王仙霞,武利庆,杨彬,张宁,苏萍,杨屹

1.北京化工大学化学学院， 北京 100029; 2.中国计量科学研究院， 北京 100029

生命科学与生物产业是21世纪最为活跃、影响最为深远的新兴学科与朝阳产业，是世界各国创新驱动与产业革命的主攻方向，其长足发展对于我国抢占新一轮科技革命和产业革命制高点、加快我国生命科学技术进步、推动生物产业发展、建设“健康中国”具有重要意义。蛋白质是生命活动的直接执行者，更是基因功能的执行者，它参与遗传、发育、繁殖、物质和能量的代谢、应激、思维和记忆等生命的所有过程，是生物体内最重要的生物大分子。当前，蛋白质科学研究已成为生命科学发展的核心领域，不论在基础研究领域，还是在体外诊断、生物医药、食品安全等应用领域，蛋白质检测都占有相当重要的比重。蛋白质检测对精确结果的需求催生了蛋白质计量技术的产生与发展。蛋白质的特性量值包括含量、活性、结构等，其中蛋白质含量描述了目标蛋白分子数的多少，是蛋白质的基本属性。蛋白质含量测定是体外诊断结果量值溯源的依据，是蛋白类药物等生物产品质量控制的重要指标，也是蛋白质其他特性量值计量的基础，因此蛋白质含量计量是蛋白质计量的首要任务[1]。

1995年国际计量局原局长Quinn T J在国际计量局物质的量咨询委员会(Consultative Committee for Amount of Substance:Metrology in Chemistry and Biology，CCQM)上提出了“基准方法”这一名词，基准方法(primary method)[2]是具有最高计量品质(也即最高的准确度)的方法，它具有两个特征，第一是操作可以被完全地描述和理解，第二是不确定度可直接用SI单位(international system of units)表述。蛋白质含量计量技术围绕精准定量和溯源到SI单位的目标，近年来逐渐建立起一些高准确度的计量方法，这些方法满足基准方法的定义，但是尚未被CCQM正式认定为基准方法，因此通常称为“权威计量方法”或“潜在计量基准方法”。这些方法包括：质量平衡法(mass balance method)、同位素稀释质谱法(isotope dilution mass spectrometry, IDMS)、定量核磁法(quantitative NMR,qNMR)、电喷雾-差分电迁移-颗粒计数法(electrospray-differential mobility analysis-condensation particle counter, ES-DMA-CPC)、高效液相-圆二色光谱联用法(high performance liquid chromatography-circular dichroism spectroscopy,LC-CD)，本文对这些方法进行了综述，以期为蛋白质含量计量相关研究提供参考。

1 质量平衡法

质量平衡法依据蛋白质(或肽段)主成分与杂质的质量分数总和为1，从总和“1”中逐一扣除相关结构类似物杂质、水分、残留的挥发性有机溶剂、非挥发性有机和无机杂质等各类杂质的质量分数得到主成分的质量分数，该质量分数即为蛋白质纯度的测量结果[3-5](式1)。在用于肽段和蛋白质测量之前，该方法已经成功应用在有机小分子的准确定量中[6-10]。

wA=1 000-(wRS+wW+wVOC+wNV)

(1)

其中,wA—目标多肽或蛋白质的质量分数，mg·kg-1；wRS—结构类似物杂质的质量分数，mg·kg-1；wW—水分的质量分数，mg·kg-1；wVOC—残留的挥发性有机溶剂的质量分数，mg·kg-1；wNV—非挥发性有机和无机杂质的质量分数，mg·kg-1。

1.1 杂质成分的扣除

质量平衡法成功实施的关键在于准确鉴定并定量出各类杂质成分并逐一扣除，如图1所示，其中结构类似物一般通过高效液相色谱-高分辨质谱联用等方式，使用不同的色谱柱、流动相、流动相梯度等，从样品中尽可能多的分离出观察到的杂质，并一一通过高分辨质谱鉴定出各个杂质，最常用的分离手段是反相高效液相色谱,如采用C18柱进行分离[11]。

图1 质量平衡法流程示意图Fig.1 Schematic diagram of the mass balance method process

肽或蛋白质的杂质大部分为目标肽段氨基酸缺失、二聚体、氧化、脱氨基等形成的杂质。应注意一些脱氨基的杂质在C18柱上有可能和主成分共同流出[12]，在杂质分析时，推荐至少使用2种不同填料的色谱柱分析脱氨基与乙酰化的肽段杂质。鉴定出的杂质尽可能合成出相应肽段的纯品，用氨基酸分析法或基于氨基酸的同位素稀释质谱法测定出各个杂质肽段纯品的含量，再通过高效液相色谱-质谱联用(LC-MS)外标法对样品中含有的各个杂质肽段进行定量，从而得到结构类似物杂质的质量分数。当杂质肽段不易合成或鉴定有困难时，可以在离子流色谱图上选择与其分子量及峰面积接近的已知含量的肽段杂质，假定这两个杂质肽段在质谱上具有类似的响应，从而可以通过已知杂质肽段的标准曲线对未知杂质肽段进行定量。

水分含量主要通过卡尔·费休滴定法[13]或热重分析法确定，其中卡尔·费休滴定法可以用水分含量有证标准物质进行方法验证或校准[14]。

残留的有机溶剂一般通过将肽段溶解在合适的溶剂中，如二甲基亚砜(DMSO)等，再用气相色谱-质谱联用(GC-MS)顶空进样的方式进行分析，以各种纯溶剂的标准物质或纯品通过外标法进行定量。

非挥发性有机和无机杂质主要是各类无机阳离子与阴离子。无机阳离子一般先用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)进行半定量扫描，如果存在含量较高的无机阳离子，可进一步采用离子色谱法、ICP-MS或电感耦合等离子体发光发射光谱仪(ICP-OES)等方法进行准确定量[15]；无机阴离子一般采用离子色谱法进行测定。不论无机阴离子的测定还是阳离子的准确定量，都应当采用具有溯源性的国家有证标准物质绘制标准曲线。当待测离子无国家有证标准物质时，可采用纯品替代，但是在含量较高时，为获得准确的结果，需要对纯品的纯度进行实验测定。如合成肽段中经常含有的三氟乙酸根，由于没有国家有证标准物质，可采用定量核磁的方法对作为标准品的三氟乙酸或三氟乙酸盐的纯度进行测定[16-18]。Josephs等[19]用质量平衡法精确测定了人血管紧张素Ⅰ的含量，结果与同位素稀释质谱与定量核磁得到的结果一致。Stocks等[20]鉴定并定量了人血管紧张素Ⅱ中的低含量杂质肽段，采用质量平衡法测定了人血管紧张素Ⅱ的含量。Bros等[21]采用高效液相色谱-高分辨质谱联用以及离子淌度质谱鉴定了Hepcidin中的杂质，并对其含量进行了测定。

1.2 质量平衡法的应用

质量平衡法已经成功应用于有机小分子和肽段含量的准确测量，成为世界各国计量研究院提高蛋白质含量核心测量能力的主要手段。但是严格的质量平衡法目前并不适用于分子量大、结构复杂、带有翻译后修饰的蛋白质的含量测定。在使用质量平衡法分析蛋白质含量时，往往采用一种简化的分析方法。首先用高效液相色谱充分分离样品中的杂质与主成分，当主成分的峰面积占所有峰面积的98.5%以上时，可按照式(2)计算蛋白质的含量。这种含量计算方式也经常用于国家有证标准物质的研制。

wA=P(1-wW-wVOC-wNV)

(2)

其中,wA—目标多肽或蛋白质的质量分数，g·g-1；P—主成分高效液相色谱峰面积占总峰面积的百分比，%；wW—水分的质量分数，g·g-1；wVOC—残留的挥发性有机溶剂的质量分数，g·g-1；wNV—非挥发性有机和无机杂质的质量分数，g·g-1。

我国最早研制的蛋白质含量标准物质GBW09815牛血清白蛋白成分量标准物质和GBW09816胰岛素(猪)成分量标准物质都采用了这种简化的质量平衡法作为定值方法之一；李佳乐等[22]也将质量平衡法用于人转铁蛋白含量的准确测定中。

质量平衡法各个杂质的测定均采用相应的国家标准物质进行溯源，因此保证了测量结果的可溯源性。与目前其他蛋白质含量测定方法相比，该方法具有更小的测量不确定度，因此成为国际上各个国家计量研究院重点发展的肽或蛋白质含量计量方法，也是各国计量研究院建立、申报肽段或蛋白质校准测量能力(CMC)的主要技术手段之一。但是，质量平衡法也有比较明显的缺点，它仅适用于纯化后的固体或粉末状的多肽或蛋白质含量的测定，不能用于溶液和基体中多肽或蛋白质含量的测定。由于方法需要对水分等进行测定，需要的样品量比较大，测一次通常需要几十毫克到数百毫克的样品量[4,16,23]，无法用于微量样品的分析,即使可以分析，方法的分析成本也比较高昂。

2 同位素稀释质谱法

同位素稀释质谱法是一种特殊的内标法，通过采用待测目标物的稳定同位素标记物作为内标，能够在样品前处理、分离和质谱分析过程中最大限度地消除系统误差与随机误差，保持目标物和内标物的比例不变，从而得到高准确度的分析结果。同位素稀释质谱法具有准确度高、适用范围广、灵敏度高等诸多优点，已在无机元素及有机小分子的准确定量中得到了广泛应用，成为CCQM认定的基准方法之一。但是，对于肽或蛋白质这类大分子的分析，一般需要将其水解成氨基酸或酶切成肽段后，通过同位素稀释质谱测定水解液中的氨基酸含量或酶解液中的肽段含量，间接计算出蛋白质的含量，水解效率或酶解效率会影响蛋白质含量测定结果的准确度。因此，肽或蛋白质的同位素稀释质谱法是一种潜在的计量基准方法。

2.1 肽或蛋白质纯物质含量的同位素稀释质谱测定

采用同位素稀释质谱法对肽或蛋白质纯物质含量进行测定时，需要首先将其水解为氨基酸，一般采用酸水解的方式，选用的盐酸浓度为6或8 mol·L-1，为了减少水解过程中的副反应，水解需要在氮气保护下进行或者在水解体系中加入少量的苯酚，可采用液相水解、气相水解或微波辅助水解等多种形式[24-30]。即使有氮气或苯酚的保护，部分氨基酸也会在酸水解过程中被破坏，只有少数氨基酸，如脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等，能够在水解过程中保持稳定，常被用来计算肽或蛋白质的含量。精氨酸、赖氨酸、组氨酸和甘氨酸也能够保持稳定，可在需要的情况下用于肽或蛋白质含量的测定[25]。

同位素标记氨基酸可采用13C、15N或D标记的氨基酸，为减少非标记氨基酸天然同位素丰度对标记氨基酸质谱检测的影响，一般要求标记氨基酸的质量数比非标记氨基酸至少大3 Da。同位素标记氨基酸在水解前或水解后加入均可，13C、15N标记的氨基酸可在水解前加入，在水解过程中这些标记氨基酸能够保持稳定；由于氢氘交换的存在，D标记的氨基酸一般应在水解后加入。如果在水解前加入，要求样品处理和水解过程中不能有转移操作，否则会影响定量准确度。

氨基酸的分离一般采用反相色谱(reversion phase chromatography, RPC)[31,32]或亲水色谱(hydrophilic interaction chromatography,HILIC)[33]进行，有时为了进一步提高氨基酸之间的分离度，尤其是亮氨酸与异亮氨酸之间的分离度，还可加入一些离子对化合物，如全氟庚酸等。质谱检测一般采用多反应监测模式(multiresponse monitoring model，MRM)进行，采用单点法或括号法进行定量，通过提取各个离子对的离子流色谱图计算峰面积后进行结果计算。通过同位素稀释质谱法测定肽或蛋白的含量，可通过国家氨基酸纯度有证标准物质最终溯源到SI单位[34]。

即便是经过纯化后的肽或蛋白纯物质，也会或多或少的含有杂质肽或杂蛋白，这些杂质在水解过程中也会释放出氨基酸，如果不加区分采用水解后的氨基酸计算肽或蛋白的含量，必然过高估计此含量值。因此，为了获得准确定量结果，在采用同位素稀释质谱测定的氨基酸含量计算肽或蛋白质含量之前，还需要对杂质肽或杂蛋白水解产生的氨基酸进行校正。校正有两种方法，第一种方法与质量平衡法中结构类似物杂质的分析方法类似，通过高分辨质谱对样品中含有的结构类似物杂质进行鉴定，然后合成出这些杂质纯品并确定含量，以这些已知含量的纯品绘制标准曲线，通过LC-MS外标法定量出这些杂质的含量，并以此计算杂质水解后产生的氨基酸的量。从同位素稀释质谱法测定的总氨基酸含量中减去所有杂质水解后产生的氨基酸的量进行校正，再用校正后的氨基酸的量计算肽或蛋白质的含量，实现目标肽或蛋白质含量的准确测定。第二种方法适合于高效液相色谱上杂质能够与主成分完全分离的情况，首先通过对色谱条件的充分优化，使样品中的主成分和杂质实现基线分离，杂质间分离情况不做要求。接着采用馏分收集的方式，在一次进样中将主成分之前的所有杂质收集于试管1中，主成分收集于试管2中，主成分之后的所有杂质收集于试管3中，分别称量3个试管中液体的质量，并在3个试管中定量加入同位素标记氨基酸后进行水解，通过同位素稀释质谱法即可测定不同试管中各个氨基酸的含量，分别记为w1、w2、w3，则主成分中某一氨基酸的比例可通过式(3)进行计算：

(3)

其中，w1—试管1中某一氨基酸的质量分数，g·g-1；w2—试管2中某一氨基酸的质量分数，g·g-1；w3—试管3中某一氨基酸的质量分数，g·g-1；m1—试管1中收集流出液的质量，g；m2—试管2中收集流出液的质量，g；m3—试管3中收集流出液的质量，g。

将样品同位素稀释质谱法测定的总氨基酸含量乘以比例因子R进行校正，再用校正后的氨基酸的量计算肽或蛋白质的含量，从而实现目标肽或蛋白质含量的准确测定。与第一种方法相比，这种方法无需对样品中的杂质进行一一鉴定和定量，大大节约了人力和分析成本，但是要求主成分和杂质必须能够基线分离。

Josephs等[23]采用同位素稀释质谱法测定了人血管紧张素Ⅰ的含量，质量平衡与定量核磁得到的结果一致；Pritchard和Kato也用该方法测定了人血管紧张素Ⅰ的含量[29,33]。Kinumi等[35]用同位素稀释质谱方法研制了可溯源到SI单位的C肽标准物质NMIJ CRM6901-a。该方法还被用于胰岛素、乙醇脱氢酶、C肽、人生长激素、C-反应蛋白、β-2-微球蛋白、胱抑素C、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、BNP、糖化血红蛋白等含量的测定[24,31,32,36-43]。

此外，还可以将蛋白质消解为无机态，然后通过同位素稀释电感耦合等离子体质谱(ID-ICP-MS)的方式，使用34S作为同位素稀释剂，测定消解液中的32S，再进行含S杂质校正后，计算得到蛋白质的含量。Lee等[44]用这种方法分析了溶液中人生长激素的含量。Schaumlöffel等[45]采用柱前同位素稀释结合纳升级高效液相色谱与ICP-MS实现了肽段的准确定量。采用ID-ICP-MS定量牛血清白蛋白、超氧化物歧化酶和金属硫蛋白的工作也有报道[46]。

2.2 复杂基体中肽或蛋白质含量的同位素稀释质谱测定

血清等复杂基体中小肽含量的同位素稀释质谱测定与复杂基体中小分子的同位素稀释质谱定量没有本质差别，同位素标记肽段一般以同位素标记氨基酸为原料通过固相合成的方法得到，要求标记肽段与非标记肽段之间的质荷比相差3以上。如果样品基质过于复杂可通过沉淀蛋白等操作去除或降低基质的干扰；当样品中目标肽段含量较低时，可采用固相萃取、亲和捕获等方式对目标肽段进行富集后测定。质谱检测通常采用MRM模式进行，要求肽段母离子和子离子的质荷比都在三重串联四级杆的检测范围内，采用单点法或括号法对肽段进行定量。

对于分子量较大的蛋白质，现有的质谱技术难以采用MRM模式直接对完整的蛋白质进行定量，需要将蛋白酶解成肽段后，从中选择特异性的肽段进行同位素稀释质谱的定量，根据酶切特异性肽段的含量，间接计算出基体中蛋白质的含量。加入的同位素内标可以是同位素标记肽段或同位素标记的目标蛋白。使用同位素标记肽段作为内标时，酶切效率对蛋白质含量测定准确度有显著影响，必须保证酶切的完全。如果酶切不完全，需要对酶切效率进行校正才能得到准确的定量结果。王洋等[47]研究发现，采用同位素标记肽段为内标对溶液中β-乳球蛋白定量时，酶切效率只有75.7%；若在奶粉基质中进行酶切，酶切效率仅为6.1%，如果不进行酶切效率校正，误差将是显著的。但是，当进行两个蛋白含量比例测定如糖化血红蛋白(HbA1c)含量测定时[43]，结果为糖化血红蛋白和糖化与非糖化血红蛋白总和的比值，这两个蛋白比较接近，酶切效率也接近，实验观察到随着酶切时间的进行，虽然酶切一直在进行中尚未达到完全酶切，但是计算出来的比例基本恒定，因此，在采用同位素稀释质谱法测定两个相近蛋白含量之比时，可以不进行酶切效率的校正。Kilpatrick等[48]采用该技术建立了血清中C反应蛋白准确定量的参考测量程序。

使用同位素标记蛋白质作为内标时，由于标记蛋白与天然蛋白的结构一致，因此酶切效率也认为相同，从而大大降低了酶切效率对基体中蛋白质含量测量准确度的影响，一般情况下酶切效率的影响可以忽略不计。同位素标记蛋白有两种获得方式，一种是体外通过同位素亲和标签试剂分别与纯蛋白标准品和样品进行反应，通过标记条件的优化确保标记效率接近100%，并通过基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)检测标记蛋白的分子量和LC-MS检测标记后特异性肽段等方式进行确认。然后将标记好的标准品与样品充分混合均匀后进行酶切，通过质谱检测标记与非标记肽段的峰面积比值，并根据加入的纯蛋白标准品的量计算出基体中目标蛋白的含量。此种方法无需基因克隆和同位素标记蛋白表达纯化等步骤，方便快捷。在使用商品化的同位素亲和标签试剂进行标记时，应进行同位素丰度的校正。李佳乐等[22]采用串联质量标签试剂(tandem quality label reagents,TMT)获得标记的人转铁蛋白，进而建立了血清中人转铁蛋白的准确定量方法。第二种获取同位素标记蛋白的方式是通过细胞培养条件下稳定同位素标记技术(stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)，在同位素培养基上通过原核表达或真核表达等方式，获得同位素标记的目标蛋白。将纯化后的同位素标记蛋白分别加入标准品和样本中进行酶切，选择特异性的肽段通过同位素稀释质谱方法进行定量。最后根据测得的特异性肽段的含量及该肽段在目标蛋白中的重复次数，计算出复杂基质中目标蛋白的准确含量。同样，当基质有可能影响准确定量时，可通过蛋白沉淀等方式降低或去除基质干扰；当目标物浓度较低时，可采用固相萃取、反相色谱、亲和捕获等方式，对目标物进行富集与净化。Pritchard等[49]采用该方法建立了血清中人生长激素的准确定量方法。

3 定量核磁法

定量核磁共振技术(qNMR)是一种基于核磁共振原理的定量分析技术。该技术是通过向待测样品中添加含量已知的标记物，然后根据被测物质的相对分子质量、选定的定量积分信号以及产生该信号的质子数，代入计算公式来实现对物质含量的检测。定量核磁共振波谱由于积分面积与质子数的线性关系，将分子精细结构的测定与绝对定量结合在一起。由于其操作简便，准确度高，不需要自身对照品就可以进行含量的测定，定量和定性测定可以同时进行，而且测定的是完整的肽段，因此该技术得到了广泛的应用。该方法的缺点是当分子变大时，谱峰会发生重叠且很难选择合适的内标，因此不适用于大分子蛋白质的含量分析。

Huang等[50]在qNMR的基础上增加了质子交换以去除多余的可交换峰，该方法使用安赛蜜作为内标分析了缬氨酸和肽T5。对于缬氨酸，其日内CV为0.052%，而8个月内的日间CV为0.071%。对于T5肽，与基于氨基酸的同位素稀释质谱法相比，操作更简单，分析时间更短且CV较小。该方法极大地提高了qNMR对小分子化合物的定量精度，并将qNMR的应用范围从小分子化合物扩展到了肽。Josephs等[23]和Melanson等[16]以马来酸为内标，分别确定了血管紧张素Ⅰ和血管紧张素Ⅱ的肽纯度。Zhang等[51]采用高效液相色谱法和核磁共振定量技术，建立了一种人C肽样品含量测定方法。Ma等[52]采用HPLC和qNMR相结合的方法测定人胰岛素(human insulin，HI)的纯度，拓展了qNMR在分子量为5 800 Da左右的蛋白质上的应用，表明该方法可广泛应用于大分子蛋白质纯度的检测。

4 电喷雾-差分电迁移-颗粒计数法

电喷雾-差分电迁移-颗粒计数是近几年新发展起来的蛋白质定量分析技术，该系统由3个部分组成，如图2所示：①带有电荷中和器的电喷雾气溶胶发生器(electrospray aerosol generator，ES)，其中电荷中和器用于中和液滴所带电荷数，将液滴上的电荷降低到修正的玻尔兹曼电荷分布，使大多数带电液滴只带一种电荷；②差分电迁移率分析器(differential electromigration analyzer，DMA)，它根据粒子大小与电荷之比获得粒子电迁移率分布，通过改变其操作电压，可以选择不同大小的蛋白质；③冷凝粒子计数器(condensing particle counter，CPC)，用来计数由差分电迁移率分析器选择的粒子。通过对蛋白质分子单体和二聚体的计数分析并依据泊松分布进行拟合，即可在无需标准品的情况下得到蛋白质分子的含量，是一种绝对分析方法。Li等[53]采用该技术建立了牛血清白蛋白和单克隆抗体的绝对定量方法；陈琰等[54]也采用该技术对牛血清白蛋白的准确定量进行了研究；Noémie等[55]用该方法分析了生物血清样品中脂蛋白的含量，最后的结果与免疫浊度法测定结果一致。

图2 ES-DMA-CPC示意图Fig.2 Diagram of ES-DMA-CPC

5 高效液相-圆二色光谱技术

圆二色光谱是根据手性物质对左旋和右旋圆偏振光的吸收系数(ε)相等的特点实现对分子构型或构象进行分析的技术。长期以来，圆二色光谱主要用于蛋白质构象的测定。一般情况下，一对手性化合物如D和L构型的氨基酸，具有大小一致、方向相反的圆二色光谱信号，当左旋和右旋的化合物等量时，化合物处于消旋状态，其圆二色光谱信号为0。这一点非常类似于天平和砝码的关系。圆二色光谱仪好比天平，当一对手性化合物的含量相等时，天平居中，圆二色信号为0。根据这一特点，可以使用D型的氨基酸对L型氨基酸定量。天然蛋白质都是由L型氨基酸组成，水解后将形成L型氨基酸的混合液，因此通过高效液相色谱-圆二色光谱联用的方式，以已知纯度的D型氨基酸为标准，可以测定出水解液中L型氨基酸的含量，再根据L型氨基酸的含量计算出蛋白质的含量。Luo等[56]以L-苯丙氨酸为例，介绍了一种基于高效液相色谱-圆二色光谱的定量方法。其定量结果与传统同位素稀释质谱法得到的结果吻合较好。由于光谱法的重复性优于质谱法，因此高效液相-圆二色光谱法结果的测量不确定度可优于同位素稀释质谱法。但是该方法与同位素稀释质谱法一样，无法克服水解过程引入的误差，并且由于圆二色光谱灵敏度不如同位素稀释质谱法，因此仅适合于高浓度蛋白溶液或纯蛋白固体含量的测定，可作为传统同位素稀释质谱方法的有益补充。Luo等[56]将该方法用于溶液中游离氨基酸和胰岛素的定量，结果与同位素稀释质谱方法得到的结果一致。

6 展望

随着生命科学的进步和生物产业的发展，对蛋白质计量技术的需求将愈发迫切。当前蛋白质含量计量技术已经相对成熟，并已建立起质量平衡、同位素稀释质谱、定量核磁、电喷雾-差分电迁移-颗粒计数、高效液相色谱-圆二色光谱等计量技术，基本上可以解决蛋白质纯品及基体中蛋白质含量准确测定问题。各种计量技术都有其各自的优势与不足，如表1所示。未来，蛋白质含量一方面将继续发展建立单分子计数等新的计量手段，另一方面将把现有计量手段进一步扩展到大分子蛋白、带有翻译后修饰的蛋白及复杂基体中痕量蛋白含量的准确测定中，从而保证蛋白质检测结果准确可比，提升我国生物产品质量，加速我国生物产业发展。

表1 蛋白质含量计量技术的比较Table 1 Comparison of protein content metrology techniques