餐饮及相关食品中病原菌活菌多重实时荧光PCR检测方法的研究与开发

柯振华

福建省产品质量检验研究院，国家加工食品质量监督检验中心(福州)， 福州 350000

农产品和食品安全是全球性问题，食源性疾病是食品安全的主要问题，由病原菌引起的食源性疾病一直是全世界关注的重点食品安全问题[1-5]。据世界卫生组织(World Health Organization, WHO)估计，全世界每年有数以亿计的食源性疾病患者，其中70%是由各种病原菌污染的食品和饮用水引起的。全世界每年约有200万儿童死于腹泻，其中66%以上是由病原菌所致。据我国卫生部公布的数据显示，我国平均每年发生一万多例食物中毒事件，由各种病原菌引起的食物中毒比例占三成以上[6-11]。

餐饮服务食品(简称餐饮食品)指通过即时制作加工、商业销售和服务性劳动，向消费者提供的食品。与预包装食品相比，预包装食品一般加工过程自动化水平高，经过食品生产许可认证，相对而言食品安全风险因素易于控制，而餐饮食品的加工制作过程多以手工作业为主，生产管理规范性低，在加工、储运以及保藏环节易受病原菌污染，存在较高的食品安全风险[12-16]。

餐饮食品及相关食品的安全管理主要涵盖食品生产加工链条安全控制以及病原菌风险控制与快速检测技术研究两方面。针对食源性病原菌检测，我国已经制定了相关国家标准，但由于标准方法多是基于传统的微生物学鉴定手段，检测步骤包括病原菌分离、培养、鉴定等步骤，对于病原菌的检测一般需要一周时间，无法满足餐饮等食品的快速检测需求，亦无法满足食品安全事件中致病性病原菌的快速检测需求，亟需开发更为快速灵敏的检测技术。

一般认为活细菌才具有致病性风险，而采用分子生物学手段进行病原菌检测鉴定，死菌与活菌DNA均能检出，所以能够有效区分死亡病原菌与活菌的检测方法才能使鉴定结果更具有说服力。国内外已有较多文献报道利用DNA染料如PMA与EMA等进行活细胞鉴别[17-20]，鉴别原理主要是利用染料鉴别细胞膜的完整性。DNA染料容易通过死亡细菌或膜损伤细菌的细胞膜，而活细菌因其具有完整细胞膜，可隔绝DNA染料。其中，叠氮丙啶(propidium monoazide, PMA)作为一种与核酸具有亲和性的叠氮类核酸染料，应用较为广泛。PMA结构中带有叠氮基团，是一种对核酸具有高度亲和力的光敏染料，自身是弱荧光的，但当其与核酸分子结合后荧光变强。PMA无法进入活细胞，因此只能选择性的修饰细菌死亡后暴露出来的核酸分子。当PMA处理后的样品暴露于强光下时，PMA所带的光敏性叠氮基团转化为高活性的氮宾自由基，并与结合位点附近的任意碳氢化合物反应形成稳定的共价氮碳键，使得核酸分子被永久修饰，最终成功阻断核酸分子的PCR扩增。同时，残留在溶液中未与核酸分子进行交联的PMA在强光照射的同时与水分子会发生反应生成无活性的羟胺，基本不影响活菌DNA的检测。

荧光定量PCR(fluorescence quantitative PCR)通过荧光基团标记探针和荧光信号强度收集检测，可实现PCR过程的实时监测，并通过Ct值对目标DNA进行定性定量分析[21-25]。

综合考虑病原菌检出率以及病原菌所带来的危害与影响，本研究选取痢疾志贺氏菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157∶H7与单核细胞增生李斯特氏菌等9种病原菌，开发多重实时荧光PCR检测方法，以期寻找能在短时间内完成病原菌检测的高灵敏度方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1标准菌株 本研究的研究对象为9种病原菌，分别是痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、沙门氏菌(Salmonella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)、副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus)、大肠埃希氏菌O157∶H7(EscherichiacoliO157∶H7)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)。

1.1.2主要仪器 ABI 7500实时荧光定量PCR仪(美国Life Tech公司)；台式离心机(Eppendorf公司)；IKA MS3 basic涡旋混合器、SterilGARDⅢ Advance生物安全柜(美国Baker公司)；HVE50高压灭菌锅(日本Hirayama公司)；移液器(Eppendorf 公司)；Milli-Q超纯水仪(MILLIPORE公司)；SILVER拍击式均质器(西班牙IUL公司)；pH计(METTLER-TOLEDO 公司)；生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；生物显微镜CX31(奥林巴斯有限公司)；DNA浓缩仪(美国Thermofisher公司)。

1.1.3试剂 试验用培养基与试剂如脑心浸出液肉汤等购自北京陆桥技术股份有限公司；PCR预混液购自上海生工生物工程股份有限公司；DNA提取试剂盒购自QIAGEN公司；DMSO购自Sigma公司；PMA (叠氮溴化丙锭)购自Biotium公司。

PMA工作液：将PMA溶解于200 μL 20%的DMSO溶液，得到5 μg·μL-1储备液，于-20 ℃避光保存。使用时，将PMA储备液稀释10倍；DNA提取液配方(1 L，pH 8.0)：1 mol·L-1Tris-HCl 25.0 mL,5 mol·L-1NaCl 5.0 mL,0.5 mol·L-1EDTA 25.0 mL,20% SDS 25.0 mL，ddH2O定容到1.0 L。

试验所用引物、探针均委托上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1通用型预增菌培养基的研制 本研究的研究对象为9种致病菌，为了节约预增菌时间以及减少操作步骤带来的污染风险，研究根据病原菌的不同菌株特性与生长条件摸索通用型预增菌培养基配方。为了提高目标菌的筛选能力，分别加入不同类型的常用培养基添加剂进行试验，以筛选出目标菌区分度较好、可同时用于多种目标菌株的预增菌用培养基。

将9种病原菌根据检出率以及影响范围分为两组，第一组为沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌、大肠埃希氏菌O157:H7、单核细胞增生李斯特氏菌。对第一组菌初步摸索了6种不同的预增菌培养基配方(表1)，采用沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌等标准菌株加入的方式，在6种不同组合培养基中培养病原菌，12 h后通过选择性平板定量，绘制柱状图。

表1 第一组病原菌6种不同组合培养基配方Table 1 Six different combinations of medium formulations for group 1 pathogenic bacteria (g·L-1)

第二组为痢疾志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌。对第二组菌初步摸索了6种不同的预增菌培养基配方(表2)，通过金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌等标准菌株加入的方式，在6种不同组合培养基中培养病原菌，12 h后通过选择性平板定量，绘制柱状图。

表2 第二组6种不同组合培养基配方Table 2 Six different combinations of medium formulations for group 2 pathogenic bacteria (g·L-1)

1.2.2PMA处理浓度以及曝光时间的确定 研究以金黄色葡萄球菌为试验菌株，设置不同浓度梯度的PMA浓度以及不同的曝光时间，探究病原菌处理的最佳PMA浓度与曝光时间。

1.2.3细菌培养、热灭活菌的制备以及PMA处理 用接种环分别挑取标准菌株瓷珠，分别在营养琼脂平板表面划线，于37 ℃培养24 h。从培养平板上挑取单菌落接种于通用型预增菌培养基，37 ℃震荡培养12 h。用移液器小心吸取500 μL菌液沸水浴15 min后，37 ℃温育30 min，之后用35.0 μg·mL-1PMA(优化后浓度)处理，混合均匀后，于暗处孵育20 min，将离心管置于500 W卤钨灯下20 cm处曝光25 min(优化后曝光时间)，期间混匀数次，使样品溶液曝光均匀。

1.2.4菌液DNA提取 在DNA制备方法的选择上，综合考虑检验效率与提取时间，采用高温裂解方法提取菌液DNA：完成预增菌后，用移液器移取1.0 mL菌液加入1.5 mL无菌离心管中，12 000 r·min-1离心5 min。吸弃上清，加入300 μL DNA提取裂解液，振荡混匀后沸水浴5 min。冷却至室温，12 500 r·min-1离心5 min，小心移取上清液至无菌离心管中，即为本实验所用目标菌DNA模板。

将提取好的菌液DNA做好标记后置于冰箱中保存，利用7500实时荧光定量PCR系统进行检测。

1.2.5引物与探针的设计与合成 根据目标病原菌基因组保守序列设计特异性引物与探针，具体序列见表3。

表3 引物和探针序列Table 3 Sequences of primers and probes

1.2.6实时荧光PCR反应体系与反应参数 实时荧光PCR反应体系(30 μL)：PCR预混液15 μL，上、下游引物各1 μL，探针0.5 μL，模板DNA溶液2.5 μL，ddH2O补足体积至30 μL。实时荧光PCR反应参数：94 ℃ 5 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。

1.2.7多重实时荧光PCR反应体系的建立和优化 多重实时荧光PCR反应是在单重实时荧光PCR的基础上，对探针的发光和淬灭基团进行验证和选择，对反应体系进行确认和优化，以实现通过一次扩增反应同时检测多个靶标DNA，提高检验效率。

多重实时荧光PCR反应成功的关键在于引物、探针的特异性以及所标记荧光基团的抗干扰性，既需要避免探针间发光基团与淬灭基团间的相互干扰，又要避免非特异性扩增，同时还要兼顾退火温度等条件，使多个目标基因片段有相近的扩增效率。

1.2.8PMA-qPCR检测目标病原菌的灵敏度 将107CFU·mL-1的蜡样芽胞杆菌等病原菌菌悬液逐级稀释10倍，制备浓度分别为107、106、105、104、103、102、10 CFU·mL-1梯度的菌液，经PMA处理，进行qPCR分析检测。

2 结果与分析

2.1 通用型预增菌培养基研制

在第一组病原菌预增菌培养基的研制上，我们选用脑心浸液肉汤(BHI)与蛋白胨为基础培养基，脑心浸液肉汤与蛋白胨提供氮源、维生素和生长因子；在添加组分的选择上，葡萄糖可为多种细菌提供能源，磷酸氢二钠为缓冲剂；氯化钠维持均衡的渗透压也作为选择剂，其浓度对菌株生长的影响较大，低浓度丙酮酸钠对多株菌的生长影响不大。第一组菌的6种不同组合培养基配方增菌效果见图1，可以看出，组合4培养基针对第一组病原菌预增菌效果较好，确定第一组病原菌的预增菌培养基配方为(1 L)：脑心浸粉17.5 g，葡萄糖3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，磷酸氢二钠3.0 g，氯化锂2.0 g，丙酮酸钠2.0 g，甘氨酸3.0 g，甘露醇2.0 g。

图1 第一组6种不同组合培养基配方的增菌效果Fig.1 Effect of six different combinations of medium formulations for group 1

将标准菌株稀释到100 CFU·mL-1后，加入上述通用型预增菌培养基中培养12 h后，稀释涂布平板进行计数。其中，沙门氏菌菌落数达到1.0×108CFU·mL-1，单核细胞增生李斯特氏菌菌落数达到2.6×107CFU·mL-1,蜡样芽胞杆菌菌落数达到3.1×107CFU·mL-1,大肠杆菌O157∶H7菌落数达到8.9×107CFU·mL-1，上述4种病原菌增殖后菌落数目均达到荧光PCR检测要求(103CFU·mL-1)。

在第二组病原菌预增菌培养基研制上，我们选用牛肉膏蛋白胨培养基为基础培养基，提供氮源、维生素和生长因子，在添加组分的选择上，乳糖可为多种细菌提供能源，氯化钠用以维持均衡的渗透压，磷酸二氢钾为缓冲剂，叠氮钠为选择性抑菌剂。通过比较研究，6种不同组合培养基配方增菌效果见图2，可以看出组合3的培养基对第三组病原菌的预增菌效果较好，最终确定第三组5种病原菌的通用型预增菌培养基配方为(1 L)：牛肉膏蛋白胨15.0 g，乳糖5.0 g，磷酸二氢钾3.5 g，甘露醇3.0 g，氯化钠5.0 g，丙酮酸钠3.0 g，甘氨酸：5.0 g，叠氮钠：0.06 g。

图2 第二组6种不同组合培养基配方的增菌效果Fig.2 Effect of six different combinations of medium formulations for group 2

将5株菌株稀释到100 CFU·mL-1后，加入上数据预增菌培养基中培养12 h后，稀释涂布平板进行计数。其中，痢疾志贺氏菌菌落数达到1.5×107CFU·mL-1，金黄色葡萄球菌菌落数达到7.3×107CFU·mL-1，副溶血性弧菌菌落数达到3.6×107CFU·mL-1，阴沟肠杆菌菌落数达到7.3×106CFU·mL-1,产气肠杆菌菌落数达到5.8×107CFU·mL-1，上述5种病原菌增殖后的菌落数目均达到荧光PCR检测要求(103CFU·mL-1)。

2.2 最佳PMA浓度的优化与PMA处理死菌的效果

通过配置一系列浓度梯度的PMA(0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μg·mL-1)进行前处理，综合评价不同PMA浓度对于死菌与活菌检测的影响(图3)，对于死菌扩增而言，随着PMA浓度的增大，死菌DNA qPCR扩增曲线的Ct值明显升高，当PMA浓度超过35.0 μg·mL-1时，反应体系的Ct值几乎不再发生变化。当PMA 浓度超过40.0 μg·mL-1时，与空白对照(不加PMA)相比，活菌DNA qPCR扩增曲线的Ct值增加，可能原因是高浓度PMA 影响了活菌DNA的qPCR扩增，综上，本研究选用35.0 μg·mL-1PMA作为最佳处理浓度。

图3 不同浓度梯度的PMA对于DNA扩增的影响Fig.3 Effects of PMA with different concentration gradients on DNA amplification

2.3 最佳曝光时间的优化

如图4所示，在0～25 min时间范围内，随着光照时间的增加，qPCR扩增曲线的Ct值迅速升高，光照时间超过25 min后，反应体系的Ct值不再发生明显变化，本研究选取25 min作为最佳曝光时间。

图4 不同曝光时间对于DNA扩增的影响Fig.4 Effects of different exposure times on DNA amplification

2.4 PMA-qPCR检测不同比例目标病原菌的线性曲线

配制10～107CFU·mL-1浓度的金黄色葡萄球菌病原菌菌悬液，在PMA浓度为35.0 μg·mL-1的条件下处理25 min，利用qPCR进行目标病原菌检测。检验结果显示(图5)，随着目标病原菌含量的增加，扩增曲线Ct值明显降低，在10～107CFU·mL-1病原菌菌液浓度范围内，Ct值与菌液浓度呈现良好的线性关系，线性回归方程为:y=-3.400 8x+41.537,R2= 0.976 8，方程中y代表DNA qPCR扩增的Ct值，x代表金黄色葡萄球菌菌液浓度的对数值。

图5 不同浓度梯度病原菌qPCR检测结果的线性曲线Fig.5 Linear curve of qPCR detection results of different concentration gradient pathogens

2.5 病原菌单重实时荧光PCR试验结果与方法特异性

在非目标菌存在的情况下，针对目标菌检验的引物和探针只能在目标菌DNA中出现扩增曲线，而其他非目标菌中均未见扩增曲线(图6)。

图6 9种病原菌的单重实时荧光PCR扩增图Fig.6 Single real-time PCR assaies of nine pathogenic bacterias

试验结果显示，本研究设计的引物与探针对目标病原菌的PCR扩增效果良好，特异性好，对于非目标菌株DNA如大肠埃希氏菌DNA未见扩增曲线，抗干扰能力较强。

2.6 多重实时荧光PCR试验结果

本研究分别尝试了不同引物、探针在多重实时荧光PCR反应的扩增效率，通过试验比较，发现三重反应的效率最佳，通过优化组合开展多种病原菌的实时荧光PCR反应，筛选出最佳的荧光报告基团与淬灭基团。

优化后的多重实时荧光PCR反应体系为(50 μL)： PCR预混液25 μL，上、下游引物各1.5 μL，探针1.0 μL, DNA 3.0 μL, ddH2O补足体积至50 μL。实时荧光PCR仪器设定的反应程序为：94 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，59 ℃ 1 min，45个循环。

研究将痢疾志贺氏菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、蜡样芽胞杆菌、大肠杆菌O157∶H7、副溶血性弧菌这9种病原菌分为3组分别开展多重实时荧光PCR试验，荧光信号未见干扰(图7)。

2.7 病原菌检测低限

将菌液浓度分别为1.3×107CFU·mL-1的沙门氏菌、3.6×107CFU·mL-1的金黄色葡萄球菌、1.5×107CFU·mL-1的蜡样芽胞杆菌、2.7×107CFU·mL-1的副溶血性弧菌、5.1×107CFU·mL-1的大肠埃希氏菌O157:H7、2.9×107CFU·mL-1的单核细胞增生李斯特氏菌、3.0×107CFU·mL-1痢疾志贺氏菌、6.3×107CFU·mL-1阴沟肠杆菌、2.9×107CFU·mL-1产气肠杆菌分别进行10倍系列稀释，探索方法检测低限。

如图8所示，通过重复试验与平行试验确认，9种病原菌的方法检测低限均可达到103CFU·mL-1。

2.8 方法间比对试验

本研究在开发餐饮食品等食品快速检测PMA-qPCR方法的同时，在标准菌株加入试验以及样品测试试验时，同时应用国家标准GB 4789系列标准作为参照方法开展方法比对工作，检验结果表明，本研究方法检验结果与国家标准方法检验结果相吻合。

3 讨论

本研究完成了痢疾志贺氏菌(Sh.dysenteriae)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、沙门氏菌(Salmonella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)、副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus)、大肠埃希氏菌O157:H7 (EscherichiacoliO157∶H7)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)等9种病原菌的快速检测方法开发工作。考虑到PCR方法抗干扰能力强，在多种病原菌混合溶液中可有效检测出目标菌，为了提升检测效率与缩短检测时间，本研究首先优化了培养基配方，开发了适用于多种病原菌预增菌用通用型培养基。采用高温裂解法提取样本中病原菌DNA，采用PMA染料选择性灭活死菌DNA，鉴别活菌，采用多重实时荧光PCR方法检测目标病原菌特异性基因片段。

引物和探针的设计与合成质量直接关系，PCR反应的灵敏度与特异性是实时荧光PCR反应灵敏度与检测效率的关键。本研究在引物与探针的设计与合成方面，分别以9种目标病原菌的保守基因序列为靶基因序列，设计了引物与探针序列，为了完成多重检测，在不同的探针上标记了不同的荧光标记基团。qPCR检验结果显示，本文所设计的引物探针仅针对目标菌DNA有扩增曲线，特异性好,灵敏度较高,抗干扰能力强。进一步通过优化引物探针浓度与退火温度等反应体系条件，充分保证了qPCR方法重复性与稳定性。

a—沙门氏菌; b—金黄色葡萄球菌; c—副溶血性弧菌；d—蜡样芽胞杆菌; e—大肠杆菌O157∶H7; f—单核细胞增生李斯特氏菌；g—痢疾志贺氏菌; h—阴沟肠杆菌; i—产气肠杆菌图7 多重实时荧光PCR扩增图Fig.7 Multiplex real-time PCR assay

每张图中曲线由上至下浓度依次为107、106、105、104、103、102、10 CFU·mL-1。图8 不同浓度梯度病原菌的方法检测低限Fig.8 qPCR detection limits of pathogenic bacterias with different concentration

在检验周期方面，现行国家标准对于病原菌的检验一般需要4～7 d时间，确证时间则更长，无法满足餐饮食品检验时效性需求，餐饮食品急需开发快速高通量的病原菌筛查检测方法。应用本研究方法可在16 h内完成餐饮食品中9种病原菌的检测，测定低限可低至103CFU·mL-1，可满足食品特别是餐饮食品的快速检测需求，适用于大规模样品的高通量筛查检测，具有较为广泛的应用前景与现实意义。本研究研发的预增菌培养基以及多重实时荧光PCR快速检测方法可进一步完善与优化，开发出商业化通用型检测试剂盒，具有较高的商业价值与应用前景。