质量平衡法及其在标准物质定值中的应用进展

郑子繁,刘卫晓,金芜军,李亮

中国农业科学院生物技术研究所， 北京 100081

为保证不同地区、不同时间测量结果的可比性，测量结果需溯源至适当的、规定的参考标准，而标准物质就是化学、生物、工程、物理学等领域材料和样品测量的参考标准[1]。标准物质是一种足够均匀的、具有一种或多种相对容易确定的特性值的材料或物质，在评价测量方法、给材料赋值及校准仪器方面有广泛的用处。如在有机化学方面，有机标准物质化学纯度定值技术是赋予标准物质准确量值的关键。有机标准物质种类繁多，在进行研制时，需根据不同样品的化学性质选择合适的测量方法[2]。近年来，生物标准物质研制逐渐成为热点领域，包括医疗领域的分子诊断、农业领域的转基因成分[3]和动植物疫病检测、食品领域掺假与微生物超标，使得新型的标准物质迅速发展。标准物质定值方法中，最权威的是基准方法。基准方法(primary method)是一种具有最高计量学特性的测量方法，其可以被完全地操作和理解，最终不确定度可以用国际单位制(SI)表述，基准方法的溯源流程见图1[4]。

图1 基准方法溯源图[4]Fig.1 Benchmark method traceability graph[4]

质量平衡法也为新型生物类标准物质研制提供了可能。它是一种常用的纯度测量方法，对样品中杂质进行分析后，将其中的各组分(如水分、灰分、有机杂质等)分别定量出来，之后从总量的100%中将其扣除，最后剩下的就是样品的纯度[5]。尽管质量平衡法在每个杂质进行定性、定量分析时的工作量十分庞大，但测定过程中并不需要待测样品的标准物质，且结果稳定性好，测量结果也比其他方法更加精确[5]。质量平衡法目前在化工、冶金、环境、医学、地质等方面的标准物质研制都有着广泛的应用[6-8]。若在各部分测量中都使用了基准测量方法推荐的方法，质量平衡法则有望成为一种基准方法。基于此，对质量平衡法原理及质量平衡法在标准物质的研制中的应用进行介绍，并对近期质量平衡法在标准物质中的最新应用进行总结，以期探索质量平衡法在标准物质研制中的更多可能。

1 质量平衡法介绍

质量平衡法(mass balance)是一种综合方法，通过应用多种分析技术进行杂质的分析。从质量分数为100%的原样品中减去可检测的杂质含量，即可获得主成分的纯度(质量分数)[4]。其计算公式如下:

纯度=[100%-w(n)]×[100%-w(s)-w(a)-w(m)]×100%[9]

式中，w(n)—非挥发性杂质的质量分数，w(s)—溶剂残留的质量分数，w(a)—灰分的质量分数，w(m)—水分的质量分数。

质量平衡法主要分为两个部分，第一部分是称量出总的质量，第二部分则是分析出样品中的各种杂质，包括非挥发性杂质(有机杂质)、水分、挥发性溶剂和灼烧残渣(无机离子)的含量，最后从总物质量中减去这些的杂质的含量即可得出该物质的含量。质量平衡法通常被认为是一种具有较高准确度的方法，其能够直接溯源到SI中质量单位(kg)，世界卫生组织及欧洲药典推荐质量平衡法为药品标准物质定值方法[5]。

2 质量平衡法中的常用分析技术

各部分杂质的测量在方法的选择上需要根据被测物质的性质决定。其中，常见的水分检测是利用卡尔费休水分滴定法；灰分(指样品中的固体无机成分)含量常用高温灼烧得到的残渣质量进行分析；非挥发的液体有机物可以用高效液相色谱法分离；挥发性有机试剂和醇类等残留溶剂的含量可以采用顶空气相色谱法，当程序升温达到不同的沸点时，不同的组分会在对应的保留时间处被检测到；无机元素残留可以用电感耦合等离子质谱法检测，且该方法可以同时检测出多种无机离子，是质量平衡法中测量无机元素最常用的方法。

2.1 高效液相色谱法

高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)又称“高压液相色谱”“高分离度液相色谱”等，是色谱法的一个重要分支。高效液相色谱的原理是以液体为流动相，用高压输液系统将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱[10]。流动相的各成分在柱内被分离后即可进入检测器进行检测，从而对试样进行分析。高效液相色谱法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术[9]。

2.2 顶空分析法

顶空分析(headspace analysis)技术可用于检测产生于分析固体或液体顶部蒸气相中的有机挥发性物质，最早报道可追溯到1939年Harger等[11]对水相中醇含量的测定。气相色谱法如何进行样品的制备和采用何种有效的进样方法一直是气相色谱成功分析的关键因素。气相色谱适用于分析挥发性和半挥发性的化合物，因此顶空分析既可以是一种可以单独处理样品的技术，也能够与气相色谱联用。与液-液萃取和固相萃取方法相比，顶空分析能专一地收集样品中易挥发的成分，这样可降低共提取物所引起的干扰，并规避在除去溶剂时引起挥发性物质的损失，这使顶空分析方法在对样品中微量的有机挥发性物质分析时比溶剂提取方法更为灵敏，分析速度更快[12]。现代顶空分析法已经形成了一个相对完善的分析体系，主要可分为3类：静态顶空分析(static headspace analysis)、动态顶空分析(dynamic headspace analysis or purge and trap analysis)、顶空-固相微萃取(head space solid-phase micro-extraction analysis)[13]。

2.3 卡尔费休法

水分的测定方法有多种，卡尔费休水分滴定法(Karl-Fischer)是其中的一种。与传统方法(如灼烧法)相比，卡尔费休水分滴定法操作更为简单，自动化程度高，测试结果较为可靠，因此得到了较为广泛的应用。卡尔费休水分滴定法在操作、准确性、精度、速度等方面都有着相当的优势。

卡尔费休试剂是由I2、SO2、吡啶和甲醇组成的溶液。卡尔费休水分滴定法的原理是，样品中的游离水和结晶水都可与已知滴定度的卡尔费休试剂进行定量反应[14]。样品在装有滴定溶剂的反应器内用卡尔费休标准溶液进行滴定，双铂电极能够自动检测终点，根据消耗的标准溶液的体积，仪器自动计算出样品中的水分含量[15]。卡尔费休反应的方程式为：

H2O+I2+SO2+CH3OH+3RN→(RNH)SO4CH3+2(RNH)I

从反应式中可以得出，甲醇是溶剂的同时还直接参与了反应。吡啶仅作为缓冲剂，并没有直接参与反应[16]。

卡尔费休法可分为容量滴定法和库仑滴定法。当样品水分含量在小于或等于500 mg·kg-1(0.05%)的情况下，使用库仑滴定法的测量可使结果更为准确[17]。使用卡尔费休库伦滴定仪测量样品中水分测定公式为[18]：

Pwater=

式中，ICEQ是总消耗电荷，将其转换为总检测出的水质量(单位：μg)；时间是以min为单位的KF库仑测量总时间；Drift(单位:μg·min-1)是在分析之前由KF库仑滴定仪测量的系统水含量；Blank(单位:μg)是测得的系统空白；m是用于KF库仑分析的样品重量(单位：g)；C是将μg·g-1单位转换为kg·kg-1的常数1×106。

2.4 电感耦合等离子质谱法

1983年第一台电感耦合等离子质谱仪问世，此后，电感耦合等离子质谱(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)得到了迅速的发展，在地质、生物、冶金、化工、环境、医学等方面都有着广泛的应用。ICP-MS可用于痕量元素的测定、同位素比对、形态分析等方面[19]。

ICP-MS分析技术是一种无机微量及痕量元素分析技术，其可进行多元素同时分析，其测试结果受到的干扰少、精密度高、线性范围宽、简便快速，检出限一般比等离子体发射光谱法(inductively coupled plasma atomic emission spectrometer，ICP-AES)低2～3个数量级[20]。ICP-MS在无机元素分析中有着诸多应用，如医药类多种微量元素测定、生物样品中微量元素的检测、地质样品中微量元素的测定等[15]，且ICP-MS已被2010年版中国药典收载于附录项下[21]。表1对上述4种方法的特性和适用范围进行了总结。

表1 常用方法特性分析Table 1 Characteristic analysis of common methods

3 测量不确定度评定模式

测量不确定度是一个统计参数，它描述了测量结果的可能波动[22]。测量不确定度可以说是与测量结果相“绑定”的。在实验室的各项研发中(如化学、医疗行业等)，实验的结果往往需要在多个实验室间进行传递比对。如果没有测量不确定度，实验结果就没有一个范围作为标准，将难以进行比对。不确定度是将来自各部分仪器、试剂、重复性等方面的不确定性进行了量值和计算，最后得到一个的区间。理论上测量不确定度应该是稳定且较低的值，但不宜过低。在质量平衡法中，测量不确定度需要统计测量各组分时使用仪器的不确定度以及所用试剂的不确定度，最终得到一个合成不确定度。

质量平衡法的不确定度uMB计算公式如下[23]:

uMB=urel(P)=

式中，urel(P0)表示液相色谱法的相对不确定度；u(XW) 表示水分测定的不确定度；urel(P)表示纯度结果的相对不确定度；u(Xa) 表示灰分测定的不确定度；u(XV) 表示挥发性物质测定的不确定度；u(Xe) 表示无机元素测定的不确定度。

3.1 不确定度来源

根据实验方法，测量各部分杂质的过程中均可能产生不确定度，如液相色谱、天平、测量的重复性和均匀性等，大致如图2所示。

图2 溶液标准物质定值不确定度来源分析及评定流程图[24] Fig.2 Source analysis and evaluation flow chart of uncertainty of fixed value of solution reference materia[24]

3.2 质量平衡法中各杂质组分的测量不确定度评定

在计量测试领域，广泛采用测量不确定度来定量地表示测量结果的质量。根据《测量不确定度表示指南》(Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement，GUM)的规定，不确定度的表示方法有：用测量结果的标准差表示的不确定度即标准不确定度，以及用标准差的倍数或说明了置信水平的区间半宽度来表示的不确定度即扩展不确定度[25]。本文对质量平衡法中常用的杂质测量方式的不确定度评定进行了总结，如表2所示。

表2 常用不确定度公式小结Table 2 Summary of commonly used uncertainty formulas

4 质量平衡法在标准物质中的应用

4.1 有机化学标准物质

有机标准物质作为参考标准广泛应用于色谱分析领域，有机标准物质化学纯度定值技术对赋予标准物质准确量值是十分重要的。质量平衡法可用于有机标准物质的定值，如在对1,2,3,4-四氯苯标准物质纯度定值中，使用了质量平衡法对多种杂质进行称量[5]。其中，使用的气相色谱用氢火焰离子检测器(gas chromatography with hydrogen flame ionization detection，GC-FID)确定杂质成分；用标准添加方式确认非挥发性杂质为1,2,3,5-四氯苯，并用气相色谱用电子俘获检测器(gas chromatography-electron capture detector，GC-ECD)对其进行准确定量。溶剂残留部分最终确定为乙醚，使用顶空GC-MS来分析，并用GC-FID对其准确定量。用库仑法水分测量仪测量水分含量，通过对比灼烧前后样品质量差异测量灰分含量。最后获得了1,2,3,4-四氯苯标准物质[5]。1,2,3,4-四氯苯是现如今使用氯化方式净化饮用水过程中产生的副产物，氯苯化合物在化工企业中有着广泛的使用，能通过多种途径进入环境，对水体、土壤以及空气造成严重污染，进而危害到人体。因此，1,2,3,4-四氯苯标准物质的研制有着重要的现实意义[5]。

4.2 食品安全标准物质

食品安全检测是保证食品安全和贸易、食品产业健康发展、促进食品科学发展的基石。在食品标准物质的研制中，质量平衡法也是常用的研制方法。双氰胺(dicyanodiamide，DCD)别名二氰二胺、氰基胍、二聚氰胺。双氰胺复合肥料使用广泛，在牧场中的过量使用，双氰胺可能会积聚在牧草中，等奶牛摄食牧草后，双氰胺最终会进入奶制品，危害人体健康；类似于三聚氰胺，双氰胺也可能被添加到奶源中，提高奶制品中可被检测到的氮元素含量[31]。在双氰胺的标准物质研制中，使用卡尔费休水分滴定仪对水分进行测定，使用电感耦合等离子质谱法测量无机离子含量，挥发性溶剂的测量则采用顶空气相色谱-质谱方法[31]。双氰胺标准物质的研制对于食品安全检测溯源体系的建立提供了技术支撑和物质保证。

4.3 临床及药学相关标准物质

药品标准物质是药品质量分析中使用的实物对照，也是药品检验不可缺少的物质。国家药品标准物质指供药品质量标准中理化测试及生物方法试验用，具有确定特性，用以校准设备、评价测量方法或给供试药品定性或赋值的物质。川皮苷又名蜜橘黄素、川皮亭、川陈皮素，是一种白色结晶性粉末，在食品、医药和化妆品等领域有广泛应用。在川皮苷(nobiletin)的标准物质研制中，用到了定量核磁法和质量平衡法共同定值的方式。使用了卡尔费休水分滴定法测量水分；电感耦合等离子质谱法和电感耦合等离子体发射光谱法测量无机离子；顶空气相色谱法测定挥发性杂质含量；HPLC-UV法测定川皮苷主成分。研制川皮苷等类黄酮纯度标准物质，可在相关柑橘产品溯源与真实性检测、保健品、化妆品和医药产品的质量监控上起到重要作用[32]。

再如，醋酸氢化可的松的标准物质研制中也用到了质量平衡法。醋酸氢化可的松的化学名称是11β,17α,21三羟基孕甾-4-烯-3，20-二酮-21-醋酸酯，分子式为C23H32O6，是一种重要的糖皮质激素类物质。但若是长期使用这种物质，通过皮肤的吸收可引起全身的副作用，导致色素沉积、产生黑斑、皮肤萎缩变薄，甚至具有致癌性。实验采用顶空进样-气相色谱法测定待测样品中的溶剂残留含量；卡尔·费休库伦法测定样品中的水分含量；用热重分析法测量灰分含量。醋酸氢化可的松标准物质的研制能在检测伪劣化妆品中起到重要作用[8]。

5 展望

本文总结了质量平衡法在标准物质研制中的常用方法和在不同领域中的应用，以及杂质分析、均匀性检验和稳定性考察等方面的不确定度评定。标准物质对于检测含量、监管质量、保障人民健康等方面有着重要的作用，而质量平衡法在诸多领域的标准物质研究中有着普遍的应用，如化学、临床、冶金、环境等等。现如今，质量平衡法在化学领域的应用越发成熟，除了常用的测量杂质方式之外，若能使用基准测量方法规定的方法，如同位素稀释质谱法(IDMS)、库伦法、重量法、滴定法、凝固点下降法等，这些方法为基于SI基本量进行的直接测量方法，或依据物理、化学理论建立起的可间接溯源到SI基本量的测量方法，较其他方法更有溯源优势，质量平衡法的准确度理论上可以更上一级。但是在生物成分分析等领域，质量平衡法的使用还较少。近期在肽段纯度的测量方面已采用了该技术体系[33]。将质量平衡法应用到生物相关的标准物质研制中，有望提升标准物质研制的定量与测量不确定度评定水平。