DNA四面体纳米结构及其在生物技术领域的应用进展

陈硕,高佳奇,王迪,龙艳,李亮*,张晓*

1.长春理工大学生命科学技术学院, 长春 130022； 2.中国农业科学院生物技术研究所, 北京 100081

DNA为双螺旋结构，是主要的遗传物质，也是制备纳米结构的理想材料[1]。DNA纳米技术是指通过利用核酸的独特特性，包括双螺旋结构、Watson-Crick碱基配对相互作用和可编程序列，来形成特定的纳米结构和纳米器件[2-3]。DNA纳米结构具有高度的可控性、可编辑性和精密度，且能够实现自下而上的自组装过程[4-5]，因而功能化的DNA纳米结构已在生物医学领域被广泛应用，如用于药物递送[6]和核酸检测[7]等。因此，以DNA为基础元件的DNA纳米技术备受关注，多种具有确切大小、形状和几何形状的DNA纳米结构已通过“自下而上”的策略自组装而成[8]。以DNA为原料，Chen和Seeman[9]最早自组装了立方体纳米结构，之后又有研究人员成功合成了八面体[10]和十二面体[11]等DNA纳米结构；Rothemund[12]使用短链单链DNA合成出了多种不同形状的DNA纳米结构，并提出DNA折纸术的概念，进一步推动了DNA纳米技术的发展。

其中，DNA四面体纳米结构作为一种简单又坚固的三维结构模型之一，因制备过程简单且产率高，能够以明确的结构和均一的尺寸进行组装，同时具有出色的生物相容性和可编程性、丰富的功能化修饰位点，且机械刚性强、稳定性高，而备受关注[13]。基于此，本文将重点介绍DNA四面体纳米结构及其功能化修饰的方式，并对其在微生物鉴定[14]、医学诊断[15]、生物传感器[16]等领域的应用进展进行综述，以期为功能化的DNA四面体纳米结构的设计和组装提供理论依据，并推动DNA四面体纳米结构的研究。

1 DNA四面体纳米结构

DNA四面体纳米结构是由4条长度相等的单链DNA等量混合、退火构成，由于DNA具有特异的碱基互补配对规则，因此可以对DNA四面体纳米结构的尺寸、引入的功能化序列和顶点位置进行精确控制。每条DNA单链形成DNA四面体纳米结构的其中1个面，每条边上的2条DNA链又能够互补配对连接在一起，这样就形成了一个尺寸可控、具有刚性的DNA三维结构[17]。如图1所示，DNA四面体纳米结构由4条DNA单链组成，每条单链被均分为3个小片段，每个小片段分别与其他3条单链中的各个小片段互补杂交形成DNA四面体纳米结构的一个面，各个小片段两两杂交形成四面体结构的一条边，每条单链的5′-和3′-端交汇于四面体的顶点处或在边上形成一个端口，交汇于端口处时，可使用DNA连接酶将端口连接，也可对其进行功能化修饰[19]。为了确保DNA四面体纳米结构的弹性和稳定性[20]，同一条单链中的3个小片段之间需要由1～2个不与其他任何序列互补配对的碱基隔开，使得DNA四面体相邻的两条边各顶点处具有一定夹角，并且各个小片段的碱基数应该为10个碱基对的整数倍。

注：S1、S2、S3、S4为4条等距单链DNA。图1 DNA四面体纳米结构的自组装示意图[18]Fig.1 Schematic diagram of self-assembly of DNA tetrahedral nanostructure[18]

2 DNA四面体纳米结构的功能化

DNA四面体纳米结构的功能化是指对其进行功能化修饰，涉及功能蛋白[21]、荧光染料[22]和核酸分子[23]等。根据功能基团或分子修饰在DNA四面体的不同位置，可分为4种修饰方式，分别为胶囊型[21]、镶嵌型[24]、顶点型[25]以及悬臂型[23](图2)。顶点型，是指在DNA四面体纳米结构的4个顶点处修饰用于分子识别的生物活性分子或特异性序列(图2A)。如Xia等[25]通过在DNA四面体纳米结构的顶点处添加肿瘤穿透肽，有效提高了胶质母细胞瘤细胞U87MG的摄取速率。胶囊型，是指在DNA四面体内部的笼状结构中放入功能化修饰的分子(图2B)。如利用DNA四面体纳米结构的中心空腔，将金纳米粒子包裹在其中，包裹了金纳米颗粒的DNA四面体纳米结构进一步组装成DNA树枝状大分子，使金纳米颗粒形成簇状，为构建等离子体纳米结构提供了新的策略[28]。镶嵌型，是指通过共轭的方式将功能化的分子或基团镶嵌在DNA四面体结构的边上(图2C)。Kim等[15]制备了一个荧光标记的DNA四面体，并利用该结构进行了前哨淋巴结成像，在活体模型系统中，成功地展示了染料标记的DNA四面体纳米结构对前哨淋巴结的可视化。悬臂型，是指在四面体结构的边臂上悬挂功能化的分子或基团(图2D)。基于该四面体功能化的方式，有研究人员设计了一种基于荧光共振能量转移的悬臂型四面体的DNA比率传感器，不仅可超灵敏地监测细胞内端粒酶活性，还可以进一步应用于端粒酶抑制剂的检测[29]。由于功能化的DNA四面体兼具自身和特异性功能分子的优异特性，所以在微生物鉴定、医学诊断和生物传感器等生物技术领域具有广泛的应用。

注：A：顶点型，可将功能分子修饰于顶点位置[26]；B：胶囊型，把细胞色素c包裹在四面体笼状结构内[21]；C：镶嵌型，双螺旋结构边上镶嵌上荧光染料用于生物成像分析[27]；D：悬臂型，将输送的药物适配体悬挂在DNA四面体的边上[23]。图2 DNA四面体纳米结构的4种功能化修饰方式Fig.2 Four functional modification methods of DNA tetrahedral nanostructure

3 DNA四面体纳米结构在生物技术领域的应用

3.1 DNA四面体纳米结构在微生物鉴定领域的应用

微生物是包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物等在内的一大类生物群体，其个体微小，但与人类关系密切，广泛涉及食品、医药、工农业等诸多领域[30]。目前，常见的微生物检测技术主要有核酸探针技术、生物传感器技术、DNA微列阵技术、免疫学技术等[31]。近年来，食品的安全健康问题层出不穷，其中影响最大的是微生物污染问题[32]。随着人们的饮食习惯的改变，食源性疾病的暴发正成为重要的公共卫生事件之一[33]。此外，流感病毒(influenza virus)也是威胁人类健康的重要因素。流感病毒是负向单链RNA病毒，其表面抗原血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)易发生变异是导致其引起世界大流行的原因[34]。

DNA四面体作为一种具有高度机械刚性的DNA三维结构，可通过对DNA探针之间的距离进行精确调控，来提高生物检测的特异性和灵敏性。朱福琳等[14]基于DNA四面体的微流控系统，提出了检测致病菌大肠杆菌EscherichiacoliO157∶H7的方法，检测细菌浓度可低至10 CFU·mL-1。与现有细菌检测方法相比，由于该方法应用了DNA四面体纳米结构，可精确调控适配体之间的距离，显著提高了细菌检测的灵敏度，为食源性致病微生物的检测提供了一种高生物识别效率的有效方法。此外，DNA四面体提供了一种简单的方法来控制生物分子受限表面，以提高生物传感界面的分子识别能力。利用巯基修饰的DNA四面体纳米探针在金界面上的高亲和力，Dong等[35]开发了一种基于DNA四面体纳米结构的电化学生物传感器，通过识别血凝素基因序列的片段来检测禽流感A(H7N9)病毒。他们还通过此方法检测了埃博拉病毒核酸序列，为埃博拉病毒的检测建立了新策略[36]。上述研究表明，DNA四面体纳米结构在基因水平上检测禽流感病毒和其他病原体具有很大的应用前景，有助于预防和控制由这些病原体引起的各种疾病。

3.2 DNA四面体纳米结构在医学诊断领域的应用

3.2.1DNA四面体纳米结构在细胞行为调控中的应用 由于DNA纳米结构具有良好的可编辑性和生物相容性，常被用作靶向运载工具，因而具有调控细胞行为的作用。对于具有分化潜能的细胞，DNA纳米结构的调控作用可将其应用扩展到再生医学领域；对于终末分化的细胞，DNA纳米结构在维持和促进增殖、迁移和自噬等方面的调控作用在某些疾病模型中具有实际重要性。

干细胞研究的主要限制之一是其所需使用的药物或材料的生物相容性差和生物利用度低[37]。而将DNA四面体纳米结构应用于干细胞为该领域带来了新的思路。研究发现DNA四面体纳米结构具有促进干细胞增殖、分化和迁移的能力，可以增强其治疗和再生作用[38]，包括脂肪来源干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、神经干细胞(neural stem cells，NSCs)和牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)，以及开发新的治疗策略来修复缺陷组织、恢复受损的神经组织以及骨骼或牙齿组织再生的相关可能性[39]。NSCs存在于神经系统中，有可能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞[40]，可以产生大量的脑细胞，并维持脑组织的自我更新[41]。最近的研究表明，DNA四面体纳米结构可以促进NSCs的自我更新[42]、驱动NSCs分化为神经元[43]。目前，以神经干细胞移植为基础的治疗方法的开发已成为临床研究的热点，有望成为对抗神经退行性疾病或由创伤和缺血性脑损伤引起的神经损伤的有力工具[44]，而将DNA四面体纳米结构与NSCs结合使用可为开发更有效的神经疾病治疗方法提供机会[45]。

DNA四面体纳米结构也显示出其作为终末分化细胞的调节因子的潜力。细胞周期素依赖激酶样蛋白1(cyclin-dependent kinase-like 1，CDKL1)是基于其与细胞周期蛋白依赖性激酶1(cyclin-dependent kinase 1，CDK1)激酶结构域的相似性而克隆的，CDK1激酶结构域被证明是促进细胞进入S期的关键细胞周期调节因子[46]。利用基因芯片分析，Peng等[47]证明CDKL1基因在DNA四面体纳米结构存在的情况下显著上调。综上所述，虽然对DNA四面体纳米结构的生物学效应的深入了解尚不清楚，但现有的研究结果可能为进一步理解和使用DNA四面体纳米结构提供理论基础。

3.2.2DNA四面体纳米结构在肿瘤给药中的应用 传统的癌症化疗药物(如紫杉醇、阿霉素等)虽然具有较强的抗癌效果，但选择性差、摄取率低且不良反应大，严重影响了患者的生活质量[48]。随着生物技术的发展，人们把注意力集中在精确的靶向治疗上。在确定了特定的治疗部位或靶基因后，治疗性基因或药物将针对相关的肿瘤细胞，从而减少药物与正常人体细胞之间的交叉反应，防止或最大限度地减少药物的不良反应，并通过减少药物剂量来避免耐药性。一般来说，开发靶向药物主要有两种方法。第一种方法是主动靶向，涉及到适配体、小分子或单克隆抗体修饰药物或药物载体的使用[49]。药物载体所携带的药物主要包括化疗药物和反义核酸序列。由于病毒载体的生物安全性相对不确定，其携带的药物仅限于反义核苷酸序列，无法携带化疗药物，因此应用范围较窄。第二种方法是被动靶向，如通过脂质体[50]。脂质体介导法虽然使用方便，但仍有一定的生物毒性，且现阶段无法获得理想的转染效率，从而限制了其应用[51]。

DNA四面体纳米结构具有良好的生物相容性、易编程性和相对稳定性。基于这些优点，研究人员可以通过编辑单链DNA将反义核酸序列固定在DNA四面体纳米结构上；还可以通过静电作用将化疗药物吸附在DNA四面体纳米结构上[52]。此外，将适配体连接到DNA四面体纳米结构以实现主动靶向，这种方式可以逆转肿瘤细胞的耐药性。适配体是一段相对较短的单链DNA、RNA或多肽，可以高亲和力和强特异性地与相应的配体结合。AS1411核酸适配体能与核仁素特异性结合，核仁素主要表达于肿瘤细胞表面。一些研究人员已经使用AS1411适配体修饰的DNA四面体纳米结构来实现DNA四面体纳米结构介导的肿瘤细胞靶向[53]。上述研究表明，DNA四面体纳米结构在肿瘤疾病治疗方面有很大的应用前景，可在肿瘤疾病的治疗上发挥重要作用。

3.3 DNA四面体纳米结构在生物传感器领域的应用

生物传感器最近作为一种新型的检测方法进入大众视野，它是一种将生物元件或响应转换为电信号的分析设备[54]。其具有高特异性、快速分析、高准确度和低成本等特性。一般来说，生物传感器需要与底物分子广泛接触才能充分发挥其性能。因此，人们致力于开发各种微结构生物传感器[55]。这些研究显示了一个普遍存在的问题，即太过致密的纳米生物传感器会导致底物分子的团聚，从而降低它们与生物传感器的结合效率。因此，纳米生物传感器必须在保持生物传感器均匀分散的同时增加与底物分子接触的可能性[56]。Feng等[57]构建了以DNA四面体纳米结构为核心的通用生物传感平台。修饰DNA四面体纳米结构后，生物传感器可以以不同的方式附着在金电极表面，它的空间构象确保了生物传感器分子的均匀分散，从而使底物和生物传感器有效结合。虽然目前有一些其他表面改性的方法来获得这种生物传感器的均匀分散，但是四面体DNA纳米结构改性只需要一个步骤，与其他方法相比更为简单[58]。

此外，DNA四面体纳米结构探针与目标序列混合后，杂交效率可达80%以上，说明由DNA四面体纳米结构组成的生物传感器具有较高的检测灵敏度[59]。如在抗原的检测中，基于DNA四面体纳米结构的传感器达到了1 pg·mL-1的检测下限，比传统的ELISA方法高出几个数量级[59]。还有研究人员构建了一种长度为17 bp的DNA四面体纳米结构的生物传感器，用于检测microRNA[60]。捕获探针设计为茎环结构，分为2个部分：一部分与microRNA目标序列特异性结合，另一部分与用生物素标记修饰的信号探针相互作用。通过测量过氧化氢后催化降解所产生的电化学信号，最终实现对microRNA目标序列的检测。对于microRNA的检测，由四面体DNA纳米结构组成的生物传感器的检测限达到了10 aM，虽然与PCR相似，但具有防止假阳性结果的额外优点[60]。并且基于四面体DNA纳米结构的检测方法不受样品的不透明度、浊度和荧光的影响，从而克服了基于光学原理的样品定量的ELISA和PCR方法的主要局限性。

医学诊断及生物研究应用的要求不断提高，为了使生物传感检测能够对临床样本中单靶标或多靶标的持续性动态监测，以及体内靶分子动态分布的实时监控。叶德楷等[13]引入DNA四面体三维纳米结构探针实现了对DNA探针自组装界面的精确调控，进而实现了对杂交热力学及动力学的调控，极大提升了传感器的性能，使生物传感检测满足了新的需求。DNA四面体纳米结构作为生物调节剂，已取得了许多令人满意的结果。它们的可编辑性使其能控制生物传感器的空间分布，从而提高了检测准确性和效率，但它的临床应用仍然存在挑战，还需要对它进行的不断探索。

4 展望

DNA四面体纳米结构具有良好的生物相容性和优异的细胞膜通透性，同时制备较为简单且产率高、尺寸以及动态性均可调节，因而在微生物鉴定、医学诊断和生物传感器等领域表现出了良好的应用前景。虽然DNA四面体纳米结构在生物调节中具有巨大的潜力，但是DNA四面体纳米结构在体内的稳定性仍是一个重大挑战，限制了其在生物医学领域的广泛应用。尽管这些问题仍有待解决，但不可否认的是，DNA四面体纳米结构代表着一种理想且简单的三维DNA纳米材料。作为静态纳米结构，可以通过多种方法修饰DNA四面体纳米结构，例如在其顶点上连接寡核苷酸，包括DNA、RNA、PNA和LNA。迄今为止，抗癌适配体AS1411已成功杂交在四面体DNA纳米结构上，可通过靶向核仁素轻松进入细胞核[53]。从静态DNA纳米结构到动态系统的演变为DNA纳米技术的广泛应用价值开辟了道路。动态系统的发展将会使DNA四面体纳米结构在更广泛的领域中服务，如疾病治疗、生物活体成像等。DNA四面体纳米结构在微生物鉴定、医学诊断和生物传感器等领域引起了极大的关注，已成为生物学和医学的重要纳米材料，同时科研工作者也正在积极拓展四面体DNA纳米结构在新兴热点(如生物安全、表观遗传学等)领域的应用。