单链抗体的开发与应用

柴小龙，袁毅君，马玉凤，赵 娣

(1.天水市秦州区口腔医院，甘肃 天水 741000；2.天水师范学院 生物工程与技术学院，甘肃 天水 741001）

动物免疫系统中抗体扮演了十分重要的角色，能够与抗原发生特异性结合，从而维持动物体的稳态，[1]所以，至今仍然有许多人在为抗体的制备和纯化而努力。自从人们在动物机体中发现抗体以来，对于它的研究就一直没有停止过，为了将其大规模地应用到医学治疗方面，科学家们研究并制备出了多克隆抗体；[2]紧接着为了得到特异性较强及较纯的抗体，又制备出了单克隆抗体，但也存在着生成的抗体只针对1种抗原决定簇，比较单一等不足之处；[3]最后为了克服单克隆抗体鼠源性强的缺点，制备出了基因工程抗体。现在，人们利用基因工程技术制备抗体，利用人抗体的部分氨基酸序列代替某些鼠源性抗体的序列，成功克服了因鼠源性抗体免疫原性太高而带来的一些不便之处。[4]单链抗体属于基因工程抗体的一种，首先通过PCR技术构建单链抗体基因，然后将其导入展示系统中进行展示和筛选，最后转入表达系统(通常为大肠杆菌)中进行批量制备。[5]单链抗体的本质是人工合成小分子抗体，因为其仅有整个抗体的一条链，所以被称为单链抗体。

1 单链抗体的起源

从细胞工程抗体到基因工程抗体，从细胞水平到基因、分子水平，抗体的制备技术一代比一代完善、成熟。目前为止，利用基因工程技术制备的抗体有：嵌合抗体、改形抗体、单链抗体、噬菌体抗体、转基因动植物抗体等，[6]其中单链抗体在近几年发展迅速，被很多行业所应用，可以说是新起之秀，在未来有很大的发展空间。

相关研究人员最早在骆驼科动物的血清中发现了单链抗体，后来在鲨鱼和鳐鱼等软骨鱼类的体内也发现有单链抗体的存在。[7]单链抗体(single chain antibody fragment,scFv)，是由重链可变区和轻链可变区经由15～20个氨基酸的短肽毗连而成。与传统抗体相比，单链抗体存在如下几方面的优势：容易渗透进肿瘤组织中；免疫源性小，可消除人抗鼠的排异反应；半衰期短，容易清除，利于解毒排出。[8]但同样也存在缺点：稳定性低、功能单一、亲和力低等。

单链抗体作为第三代抗体(基因工程抗体)的一种，受到人们的广泛关注，按时间先后顺序依次出现了：单价单链抗体、单链抗体多聚体和双特异性单链抗体。

1.1 单价单链抗体

单价单链抗体的主要特点是：只具有一个抗原结合位点，只能与一个抗原决定簇特异性结合，是目前研究出来的最简单的单链抗体。1988年，Bird和Huston等第一次将单链抗体研制出来，他们首先利用PCR技术扩增出具有杂交瘤细胞特性的重链可变区和轻链可变区基因，然后用寡核苷酸(能够编码弹性短肽)连接起来，最后插入大肠杆菌中进行表达，得到能自发折叠成天然构象，其抗原亲和性几乎与完整抗体相同的单链抗体。[9]1990年，Chaudhary等成功地制备出了免疫毒素。[10]在以后的十几年时间里，相关研究人员进一步尝试用一些真核生物或植物进行表达并获得成功。

1.2 单链抗体多聚体

因为单价单链抗体存在局限性，科学家们又研制出能与多个抗原决定簇特异性结合的单链抗体，称为单链抗体多聚体。相关研究认为[11]：随着连接重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列(Linker)长度的变短，会依次形成二价二聚体、三价三聚体等单链抗体多聚体。

1.3 双特异性单链抗体

经过进一步研究发现，可以将两种来源不同的重链可变区和轻链可变区基因连接，进而让其表达出两种可以与不同特异性抗原结合的分子，这样的单链抗体具有双特异性。双特异性单链抗体具有能与特异性抗原结合；降低与某些细胞发生非特异性结合的可能性；因不需要进行细胞杂交，提高了制备效率等优点。[12]1993年Holliger等最先制备出了双特异性单链抗体。[13]

表1 单链抗体发展历程中3种类型的优缺点比较[5]

2 单链抗体的制备

图1 单链抗体的制备流程[1]

如图1所示：制备单链抗体时，首先利用PCR技术扩增出重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因，然后用Linker连接起来，紧接着导入展示系统中进行展示和筛选，最后转入表达系统中进行批量生产。

2.1 单链抗体的展示系统

展示系统，顾名思义它的作用就是对构建好的单链抗体基因进行展示和筛选，以达到观察清晰及检测是否达标的目的。这是单链抗体的制备过程中十分关键的一步，因此有必要详细阐述一下。目前为止，单链抗体的展示系统主要有以下三种。

2.1.1 噬菌体展示技术

噬菌体展示技术是目前应用最广泛的单链抗体制备技术。[14]利用噬菌体展示技术制备单链抗体时，首先获得噬菌体的蛋白质编码基因，然后利用基因工程技术，使单链抗体片段与其基因片段相连接，因为噬菌体的蛋白质存在于表面，所以间接的单链抗体就会在噬菌体表面进行表达，有利于单链抗体的筛选及鉴定。胡小丽等[15]从大容量甲状腺髓样癌(MTC)人原噬菌体单链抗体库中筛选出特异性的抗MTC单链抗体，并鉴定了其生物学特性；王建平等建立了人源性阿尔茨海默病(AD)噬菌体单链抗体库，为筛选β-淀粉样蛋白的人源性抗体提供了可靠保障；冯荣虎等创立了兔天然抗体库，再一次证明了噬菌体展示技术的可靠性。

2.1.2 核糖体展示技术

核糖体展示技术具有展示速度快、亲和力高以及可在体外筛选等优点。首先使新生单链抗体与其mRNA连接形成复合物，再使与抗原具有高度亲和性的mRNA进行富集，最后通过PCR反转录得到扩增产物。但在此过程中若没有对DNA聚合酶进行功能校对，则容易发生基因突变。[16]

2.1.3 酵母表面展示技术

酵母表面展示技术对于筛选具有高特异性和高亲和力单链抗体十分有效，但由于酵母转化效率过低延长了实验周期，从而限制了筛选抗体的产量和种类。该技术的最终目的是使重组蛋白连接到酵母细胞的细胞壁上。例如，蛋白质可以通过与α-凝集素黏附受体融合展示在酵母菌细胞壁上。[17]酵母表面展示技术主要利用了酵母细胞的内质网，使重组蛋白能够准确折叠。

表2 单链抗体3种展示技术的优缺点比较[6]

2.2 单链抗体的表达系统

2.2.1 原核生物表达系统

原核生物结构简单，生长周期短，经常被用作单链抗体的表达载体。大肠杆菌作为原核生物的典型代表，具有生长速度快、价格低廉、操作方便等优点，很适合单链抗体的长期大规模生产。[18]Mill⁃er等发现，大肠杆菌是所有单链抗体表达系统中表达速度最快的。目前主要有包涵体表达和分泌性表达这两种表达方式，其中包涵体表达虽然速率更快，成功率更高，但是产生的抗体分子没有抗原结合活性，这点分泌性表达就很好地弥补了。除此之外，科学家们也曾尝试将其它的原核生物作为单链抗体的表达系统，但结果不太理想。综合各种因素，大肠杆菌作为单链抗体的表达系统是最早被使用，目前研究最清楚，最实惠，最适合大规模生产的，是许多工厂的首选，是目前应用最广泛的。

2.2.2 真核生物表达系统

原核生物表达系统普遍存在着表达不够彻底的问题，不能很好地将一些抗体分子片段完整的连接起来。针对这一现状，科学家们想到了利用真核生物。[19]在不断地摸索试验中，人们发现酵母是所有真核生物中最适合作为单链抗体表达系统的，它不但能够弥补原核生物表达系统的缺点，而且成本低、产量大、效益高。[20]相关研究者还发现：酵母的糖基化方式与高等真核生物极其相似，且还有很大的研究空间，有更多的潜能值得被挖掘。[21]除此之外，还有一些昆虫、哺乳动物细胞也可作为单链抗体表达系统。

2.2.3 植物表达系统

随着基因工程技术的发展，人们发现植物的一些组织、器官也可被用于单链抗体的表达。比如，1992年，Weran等发现单链抗体可以在转基因烟草中进行表达，并且其作用可延续到下一代。转基因植物表达系统在生产疫苗方面应用广泛。

如1989年，Hiatt等首次利用转基因植物表达抗体：在植物体内，两个重组基因产物能够正确折叠、组装成与脊椎动物来源有相同功能的异二聚体抗体。1990年，Daring等利用转基因烟草成功表达了具有生物活性的重组抗体(IgM)。1991年，Benvenuto等在转基因烟草中表达了重链可变区(VH)片段。1993年，Firek等在转基因烟草中表达了单链Fv片段。

3 单链抗体的应用

3.1 单链抗体在肿瘤治疗方面的应用

3.1.1 靶向治疗

单链抗体在肿瘤靶向治疗领域应用广泛。比如对一些急性白血病的治疗，单链抗体的靶向治疗就发挥了重要作用。N.Kanagawa等成功构建了可特异性结合血管内皮生长因子受体(VEGFR2/flk1)的ScFv－CTL，可用于肿瘤细胞的定向治疗。近年来，对于单链抗体在肿瘤靶向治疗方面的研究，主要有单链抗体融合蛋白、靶向性病毒载体及靶向脂质体等。德国学者Eckerd等研制出一种双特异性单链体，能够通过避免使表皮生长因子受体(EGFR)和Met相结合，从而抑制肿瘤细胞的生长。

表3 不同表达系统蛋白质表达及翻译后修饰情况的比较[7]

3.1.2 肿瘤诊断

与传统抗体相比，单链抗体具有分子量小、穿透力强等优点，可以快速、高效地进入肿瘤细胞内部[22]，也因其特异性良好能够避免非特异性损伤，所以在肿瘤诊断、影像分析与治疗方面经常使用。比如首先将针对肿瘤特异性抗原的单链抗体进行放射性同位素标记，然后将其注入体内，以找到肿瘤的相关位置（定位），然后对其进行诊断与分析，最后就可以进行放射性免疫治疗。[23]比如国外研究者得到了一种特异性单链抗体(DUP21)，有助于前列腺癌的诊断。段红等发现的一种免疫脂质体(脂质阿霉素)，对裸鼠鼻咽癌有明显的抑制作用。

3.1.3 肿瘤治疗的其他应用

经研究发现，Anti-CHMP5单链可变区逆转录病毒能够感染细胞并使其进行程序性死亡，[24]如此，就可以使AML白血病细胞死亡，从而达到治疗目的。双特异性抗体属于单链抗体的一种，对肿瘤治疗意义重大，可对肿瘤细胞进行识别和消灭。2014年，Patel等研制出的双特异性单链抗体，利用这种抗体可以消灭腺病毒。[25]此外，还有相关研究表明可利用ELISA和免疫印迹技术直接检测抗原。

3.2 单链抗体在感染性疾病领域的诊断与治疗

在我们的日常生活中，经常遭受着各种感染性疾病的迫害，其中对于有些疾病可通过注射疫苗和抗生素来进行预防和治疗，比如流感病毒等，但对于一些目前还没有可能得到彻底治疗的药物的疾病，比如严重急性呼吸综合症(SARS)、艾滋病(AIDS)等，科学家们发现还有赖于相关抗体的治疗。

3.2.1 在抗病毒方面的应用

单链抗体之所以能抑制机体内的病毒，是因为它可在病毒宿主细胞内表达并特异性识别病毒的功能性蛋白质。因此，单链抗体在抗汉坦病毒、HCM及HBV等方面应用广泛且功用显著。目前发现人源化抗体Palivizumab(已获得美国食品药品监督管理局FDA的准许)可用于因呼吸道合胞病毒(RSV)而引起的小儿肺炎，且临床效果很好，显著降低了其发病率。[26]相关学者还发现单链抗体可用于抗乙肝病毒。[27]我国利用近年来炙手可热的基因工程抗体技术，在世界上首先建立了基因工程SARS抗体库，使SARS的预防、诊断和治疗更加完善。[28]此外，王庆等[29]创建了单链抗体基因文库，获得了针对呼肠弧病毒VP4的单链抗体。吴健敏[30]等人找到了快速检测出CSFV病原的方法，为以后检测其他类似抗原提供了有效方案。

3.2.2 在抗细菌方面的应用

我国相关研究者利用单链抗体在植物、动物抗细菌等方面的研究成绩斐然。比如李蒙等通过对柑橘溃疡病的相关研究，为制备病害治疗性抗体提供了可靠保障。[31]武晓丽等构建了一种单链抗体，可用于抗肠炎沙门菌。[32]

3.2.3 在抗寄生虫方面的应用

可应用于免疫学诊断方面并且其疗效与动物源性抗体不相上下。White等建立了抗血矛线虫噬菌体抗体库。Yoshida等成功制备了抗疟原虫双特异性单链抗体。单链抗体作为基因工程抗体的一种，具有人源化和可批量生产等明显优势，因此目前相关研究者普遍将其应用到疟疾的诊断和治疗方面，[33]比如汪世平等构建了日本血吸虫未成熟卵的单链抗体基因库。[34]此外，双特异性单链抗体可用于寄生虫病的靶向治疗。

3.3 自身免疫疾病研究

自身免疫疾病的出现是因为机体自身产生的一部分抗体发生病变，导致其亲和力异常增高，使机体免疫系统功能降低，产生病变。比如风湿、艾滋病等是典型的自身免疫疾病。而单链抗体在艾滋病方面应用频繁，目前已成功制备出的单链抗体ScAb2219，可有效抑制HIV病毒的早、晚期感染，有望成为艾滋病基因治疗的主要手段。[35]b12-scFV作为HIV-1疫苗的可溶性单链抗体，对于它的研究意义重大，比如Yang和Wang发现了艾滋病被动免疫防治方法，为b12-scFV的制备提供了方便。[36]刘秀侠等使距离更高效HIV-1疫苗的研制成功更进一步，发现了b12-scFV的合成及其在大肠杆菌中表达的方法。[37]

3.4 单链抗体在食品安全方面的应用

3.4.1 毒素检测

食品中常见的毒素有黄曲霉菌、莫能菌素以及沙门杆菌等。研究发现，利用单链抗体的特异性识别功能，可以检测出食品中的黄曲霉菌，这种方法既高效又成本又低，十分可行。[38]此外，Makvan⁃di-Nejad等成功制备出了抗莫能菌素单链抗体，可检测出食物中的莫能菌素；[39]T.Meyer等构建的抗沙门杆菌单链抗体，能检测出食物中是否存在沙门杆菌感染。[40]

3.4.2 农、兽药残留检测

由于农药等一些防虫、杀虫试剂的广泛使用，现在的农产品中有药物残留的现象已十分普遍，并且大多数的药物残留不溶于水，所以对农、兽药残留的检测已必不可少。同样，单链抗体在这方面也发挥了重要作用，比如，广谱性抗体可更快速有效地检测分析出农、兽药残留；[41]寇立泉等构建出了有机磷抗体库，从而使食品中的有机磷可被高效检测出。

3.4.3 食品中重金属污染检测

传统、常用的检测方法有比色法、试纸法、酶学法、电化学法、原子吸收法、原子荧光光谱法、电感耦合等离子体法等，但这些方法优、缺点并存。[42]对此，科学家们利用单链抗体又研究出了一些新技术，比如功能核酸中的核酸适体法，通过利用重金属与核酸适体特殊反应的产物可检测出光、电学信号，从而分析样品进行检测食品中是否含有重金属。核酸适体的本质是单链抗体，但又具有普通抗体所没有的一些特性：可在体外筛选、靶分子范围广、稳定性好、具有可逆性、可进行酶扩增、剪切等。[43]

4 展 望

相较于一些细胞工程抗体，单链抗体确实存在许多优点而使得其被广泛运用。但是，至今仍有需要改进或进一步研究的地方，例如：稳定性不是很好，有时会形成聚合物，不利于长期使用；虽然双特异性抗体目前已经有所发展，但是不易制备，造成其实际应用不多；尽管目前已经对因使用免疫毒素而带来的一些副作用进行了防护，但是不够彻底仍然存在一些问题，比如出现血管渗漏综合征就是因为免疫毒素的使用而引起的。[44]单链抗体的不足之处远不止这些，但是通过以上几方面的介绍，我们可以很明显地得出一个结论：单链抗体还有待更深层次的研究，从而取其长补其短，以便更好地造福人类。