不同类型胎儿先天性心脏病的产前诊断及预后分析

黄杏玲 邓新娥 王远流 陈惠 刘百灵

柳州市妇幼保健院（广西柳州545001）

先天性心脏病（congenital heart disease，CHD）是最常见的出生缺陷，在活产新生儿中占0.8% ～1.3%，是全世界婴儿发病和死亡的最大病因，也是全球经济负担的重要来源［1］。染色体异常、单基因病、环境致畸、母体暴露和感染因子都被认为是CHD的潜在病因，约20%的CHD在产前被诊断为染色体异常［2］。随着外科技术、介入技术和医疗技术的进步，出生后的CHD患者的预期寿命在过去几十年里显著提高，并可获得正常的心脏功能［3］，但染色体异常综合征型的CHD，严重的心外结构异常和/或产后神经发育障碍会导致CHD胎儿预后不良。因此强烈建议对胎儿CHD的染色体异常进行产前诊断。在过去的临床实践中，染色体核型分析是检测CHD胎儿染色体异常的主要方法。然而，核型分型是费时的，分辨率低，并不能满足目前临床检测的需要。二代测序技术是近年来迅速发展起来的以高通量、低成本、速度快为主要特征的技术，能在一次检测中分析整个基因组范围的CNV及其所影响的基因，并为疾病基因的发现及基因型-表型关联分析提供强有力的工具［4］。因此，本文通过应用染色体核型分析及低深度拷贝数变异测序（copy number variation sequencing，CNVSeq）技术两种方法，同时对CHD胎儿进行产前诊断，判断是否存在染色体遗传综合征，在孕期通过早发现、早诊断和早干预，可最大程度减少综合征型CHD患儿的出生；通过分析不同类型CHD的染色体畸变检出情况，探讨不同类型CHD与染色体畸变的关系，评估CNV-seq在胎儿CHD的应用价值，为临床咨询及评估胎儿预后提供可靠依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象以2017年1月至2019年5月在柳州市妇幼保健院进行超声颈项透明层的检查和/或系统彩超或针对胎儿超声心动图检查等，被产前超声诊断为胎儿心脏异常伴或不伴心外异常的孕妇为研究对象。本研究已通过医院伦理审查委员会的审查。纳入标准：（1）经两名具有产前超声诊断资质的医师诊断胎儿心脏结构异常伴或不伴心外异常的孕妇；（2）经产前遗传咨询并知情同意行介入性产前诊断。排除标准：（1）有介入性产前诊断禁忌或拒绝产前诊断的孕妇；（2）心脏表型只涉及心律失常或心包积液的胎儿或重度地贫的胎儿。最终纳入研究病例共有181例，181例按是否伴有心外结构异常分为独立型CHD组146例和伴有心外异常CHD组35例，按心脏缺陷的类型分为9类，见表1。

1.2 研究方法

1.2.1 介入性产前诊断所有孕妇均进行产前遗传咨询，并被充分告知相关产前遗传学诊断的必要性、局限性及风险，经孕妇知情同意及签署知情同意书后根据孕妇就诊孕周不同采用不同的介入性穿刺术，所有介入性操作均严格按照产前诊断管理办法中的介入性产前诊断穿刺术常规进行。

1.2.2 染色体核型分析所获取的羊水和脐血进行细胞培养后，以G显带染色（必要时加做C显带或N显带）制备染色体标本，每例标本按照ISCN（2016）标准，油镜下分析20个分散好、中等长度的中期分裂相，发现嵌合体或异常核型时加数到100个分裂相。

1.2.3 CNV-Seq 技术分析（1）提取基因组DNA；（2）DNA文库构建；（3）上机测序；（4）生物信息学分析；然后通过检索UCSC、DECIPHER、OMIM、Clin Var、DGV、PUBMED等数据库进行CNV临床意义的确定。

1.2.4 随访对所有病例均进行电话随访妊娠结局及新生儿情况。

1.2.5 统计学方法采用SPSS 19.0统计软件进行数据资料处理，采用卡方χ2检验（Fisher′s检验）对组间染色体畸变检出率进行统计分析，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 超声检查结果181例胎儿CHD按心脏缺陷的类型分为9类：其中最常见的为室间隔缺损，占所有病例的33.1%；其次为圆锥动脉干畸形（conotruncal defects，CTD）占10.5%。按是否伴有心外结构异常分为独立型CHD组（146/181，80.7%）和伴有心外异常CHD组（35/181，19.3%），见表1、2。

2.2 181例胎儿染色体畸变结果染色体核型分析检出染色体畸变共有20例（20/181，11.0%），包括15例染色体非整倍体（以21-三体、18-三体为主），1例嵌合体，4例结构异常。CNV-Seq分析检出43例（43/181，23.8%）CNVs，其中28例（28/181，15.5%）为致病性CNVs（含20例与染色体核型分析一致的染色体异常和8例亚显微结构异常的致病性CNVs）；7例（7/181，3.9%）临床意义不明的变异（various of unknown significance，VOUS）；CNV-Seq分析比传统染色体核型分析额外检出了8.4%的染色体畸变。

2.3 不同类型CHD染色体畸变情况独立型CHD组染色体畸变检出率为9.6%（14/146），伴心外异常CHD组检出13例（13/35，37.1%）染色体核型异常和1例亚显微结构异常。伴心外异常CHD组的染色体畸变检出率显著高于独立型CHD组，差异有统计学意义（40.0%vs.9.6%，P ＜0.05），见表2。

表1 胎儿先天性心脏病表型分类Tab.1 Classification of fetal congenital heart disease phenotypes

表2 不同类型CHD 胎儿的染色体畸形检出结果Tab.2 Chromosomal malformation detection results of different types of CHD fetuses 例（%）

2.4 妊娠结局的随访181例孕妇均接受电话随访，分娩活产儿117例（64.6%，117/181），优生引产62例，死胎引产2例。64例引产胎儿中，主要包括遗传综合型CHD和复杂CHD胎儿；117例活产婴儿中，5例发现伴有心外结构异常，包括尿道下裂和胸椎畸形、左手轴前多指、双侧瞳孔缺如、腭裂和下颌小、外耳畸形；1例因合并肺炎死亡；其他新生儿一般情况良好，未发现神经发育障碍等异常。

3 讨论

3.1 不同类型胎儿CHD的染色体畸变分析染色体异常与CHD的发生发展密切相关，系列研究报道胎儿CHD染色体异常发生率约10%～30%［2，5-6］。吴莉等［7］报道胎儿CHD染色体核型分析异常染色体检出率为9.7%（7/72），而通过SNP分析技术，染色体拷贝数异常的检出率为16.7%（12/72），其中有明确临床致病意义的为13.9%（10/72）；郭珍等［8］研究30例胎儿右位主动脉弓染色体核型异常的发生率为10%，致病性CNV检出率为23.3%；BENSEMLALI等［9］研究表明伴有心外畸形的CHD胎儿染色体畸变发生率为29.1%；DELEA等［10］研究报道圆锥动脉干畸形占CHD的10% ～30%，其染色体畸变发生率为25.8%。不同研究均报道了CHD与染色体异常的密切关系，是CHD发生发展的重要机制之一，但是不同研究的报道染色体异常的发生率有所差异，考虑主要与纳入的研究对象及分析的方法不同相关。在本研究中，纳入181例胎儿CHD染色体核型分析异常发生率为11.0%（20/181），而通过CNV-seq分析，染色体拷贝数异常检出为23.8%，其中有明确致病意义的CNV占15.5%，临床意义不明的变异为3.9%。CNV-Seq技术比传统染色体核型分析额外检出了8.4%的染色体畸变，提高了CHD胎儿的染色体畸变检出率，是染色体核型分析有效的补充检测手段。本文还描述了不同类型CHD的染色体异常频率和分布，不同类型的胎儿CHD染色体畸变检出率不一样，CHD伴心外异常组的异常检出率显著地高于独立型CHD组（40.0% vs. 9.6%），两组比较差异有统计学意义（P ＞0.05），这与BENSEMLALI等［9］研究报道相似。在一些系列研究里［11-13］，与染色体异常相关的CHD最常见的是房室间隔缺损（40% ～67%），发生率最低的是完全性大动脉转位（4%），但在本研究中，独立型胎儿CHD中以右室流出道异常、复杂的锥干异常和孤立的瓣膜异常染色体畸变检出率较高，分别为37.5%、37.5%和25.0%，而左室流出道异常、左室发育不良综合征、内脏异位综合征的检出率最低。原因考虑为纳入的研究病例不同。另外，本研究发现携带致病性CNV及VOUS胎儿中独立型CHD组以染色体微缺失/微重复为主，2例22q11.2微缺失的胎儿都表现为独立型CHD，合并心外异常组以染色体非整倍体为主。DASOUKI等［14］研究也发现CNVs高频率出现在间隔缺损患者中，这进一步佐证的CNV是影响心血管发育和功能通路主要原因之一，从而为CHD发病机制中的复杂致病机制的研究提供了检测手段和切入点。综上表明，本研究为进一步了解胎儿CHD的遗传学病因及分析胎儿CHD表型与CNV的相关性提供契机，为胎儿CHD的精准遗传咨询和临床诊治提供可靠的依据，也为胎儿CHD的遗传学病因积累了数据。

3.2 CNV-seq 技术在胎儿CHD 的拷贝数变异分析中的应用拷贝数变异（copy number variantion，CNV）是神经发育障碍和先天性畸形谱系的一个广泛的已知原因［15-16］。CNV通常大小为1 kb（千碱基）或较大，不能用标准核型分析诊断。目前对CNV的检测平台主要有CMA和CNV-seq技术平台，两种检测平台均能对胎儿CHD进行有效的检测。基于二代测序技术的CNV-seq技术是近年迅速发展起来的一种以高通量、低成本、速度快为主要特征的技术。WANG等［17］研究表明：与CMA平台相比，CNV-seq识别出了额外的且具有临床意义的CNV，具有更高的分辨率和更高的检测嵌合现象的敏感性。WANG等［18］在一项大型前瞻性临床研究中也表明，CNV-seq在胎儿异常方面的产前诊断具有很高的可靠性和准确性。2019年我国专家共识提出并推荐CNV-seq技术可作为一线产前诊断技术［19］。在胎儿CHD研究方面，ZHU等［20］在胎儿心脏畸形研究中运用CMA和CNV-Seq两种技术采用盲法进行检测，结果显示CMA与CNV-Seq对CNV的检测敏感性和特异性相当，同时表明了CNV-seq能额外提高CHD染色体异常的检出率；本研究也发现应用CNV-Seq技术在CHD胎儿中染色体畸变的检出率为19.4%，比传统染色体核型分析额外检出了8.4%的染色体畸变，其中有明确致病意义的CNV占15.5%。前述研究说明了CNV-seq是CHD胎儿的产前诊断中一种更具临床适用性检测技术。但本研究同时检出临床意义不明的变异为3.9%，VOUS是CNV-seq的主要局限性之一，SHI等［21］运用CNV-seq分析114例胎儿产前CNV来源和变异类型的研究表明：72.3%的胎儿CNV来自父母，27.7%是新发变异；其中父母来源的CNV胎儿结局更好。因此，对发现意义不明的CNV可对父母进行CNV检测，对咨询更有帮助。但是，在本研究里，父母双方因经济原因多数未行CNV检测，不能追溯意义不明CNV的来源，造成咨询困难。

3.3 胎儿CHD 的预后分析HOPKINS等［5］研究表明，与CHD相关的遗传综合征的产前诊断以及产科、遗传和儿科医师之间的密切沟通有助于优化母婴结局。ZIMMERMAN等［22］研究也表明在中、低收入国家也能对产前诊断CHD胎儿及时采取有效措施从而优化CHD婴儿结局。在本研究中，分娩活产儿117例（64.6%，117/181），终止妊娠62例，宫内死胎2例。64例引产胎儿中，主要包括了遗传综合型CHD和复杂的CHD。117例活产婴儿中，94.9%预后良好，未发现神经发育障碍等其他异常。通过对胎儿CHD进行适宜的产前诊断，鉴定相关的遗传综合征或主要的心外异常有助于了解病因，此外，它还可评估预后和再发风险，指导临床诊治，同时强烈影响父母选择终止妊娠或产后护理的决定，帮助优化新生儿结局。