长链非编码RNA淋巴细胞白血病缺失基因1在食管鳞癌中的表达及其对细胞增殖、迁移和侵袭的影响

顾术东 缪捷飞 沈洪 张曙 茅国新

南通大学附属医院1肿瘤科，2病理科（江苏南通226001）

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类无蛋白质编码功能的RNA，其长度一般超过200个核苷酸，具有调控基因表达功能，在细胞的增殖、侵袭、迁移、凋亡等多个生物过程中发挥重要的调节作用［1-2］。研究［3-6］发现lncRNA在多种恶性肿瘤中表达异常，并可以通过调节肿瘤细胞的生物学行为促进肿瘤的发生和进展。淋巴细胞白血病缺失基因1（deleted in lymphocytic leukemia 1，DLEU1）定位于染色体13q14.3上，研究发现其在多种恶性肿瘤中表达升高并发挥重要作用，但目前其在食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）中表达的临床意义及对细胞生物学行为的影响尚不清楚［7-8］。本研究通过检测DLEU1在ESCC中的表达，对ESCC患者DLEU1的表达与临床病理特征及预后的关系进行分析，探讨ESCC细胞中DLEU1表达对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 一般材料收集南通大学附属医院2016年1月至2018年6月间收治的食管癌术后病例50例，均经组织病理学诊断为鳞癌。患者年龄31 ～77岁，均为初治，术前未接受放化疗等新辅助治疗，随访截至时间为2019年12月31日。

1.2 试剂材料Trizol试剂（美国Invitrogen公司），RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒（美国Thermo公司），含绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GTP）基因的DLEU1特异性干扰质粒（上海吉凯基因），LipofectamineTM 2000（美国Invitrogen公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养与转染ESCC细胞株（ECA109、EC9706、TE13）购自上海生命科学研究院，放置于37 ℃含5%CO2的细胞培养箱中培养。小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）干扰质粒由上海吉凯基因有限公司设计合成，DLEU1 siRNA1序列：5′-CAACGGAAUGUAUCAAUGA-3′，DLEU1 siRNA2序 列：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′，DLEU1 siRNA3序列：5′-GCAGAAAGGAAGTTTAT-3′。根据说明书，使用LipofectamineTM 2000将DLEU1 siRNA转染至ESCC细胞，48 h后收集转染的细胞，实时荧光定量PCR检测转染效率。

1.3.2 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）参照试剂说明书进行总RNA的提取，超微量核酸蛋白分析仪测定RNA浓度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整度，采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒将RNA逆转录为cDNA，在PCR仪上进行检测。PCR特异性引物序列如下：DLEU1正向引物序列：5′-CACGTGCATTTAAAACCGCC-3′，反向引物序列：5′-AAGACTTTGGGGCAGATTTCTT-3′，GAPDH正向引物序列：5′-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3′，反向引物序列：5′-GCGGCGCATACGAATGCCCC-3′。采用荧光定量PCR仪进行DLEU1表达的相对定量分析。以GAPDH作为内参，每个标本检测3次取平均值，采用2-ΔΔCt法计算DLEU1的相对表达量，以DLEU1的中位表达值为截点，高于中位表达值定义为高表达。

1.3.3 划痕实验取转染后细胞，在6孔板中种入6 × 105细胞，待细胞长满单层后进行划痕实验，磷酸盐缓冲液冲洗，去除划下细胞，培养24 h后观察并拍照。

1.3.4 Transwell 侵袭试验按Transwell小室操作说明书分别将转染后细胞及对照组细胞悬液接种于上室，小室下面加入培养液作为化学引诱剂，在37 ℃培养箱中孵育48 h后，吸去培养基，甲醛固定侵入下室的细胞，结晶紫染色，显微镜计数移到膜下层的细胞，并拍照。

1.3.5 CCK-8 细胞增殖实验取转染后的试验组及对照组食管癌细胞，以5×103个/孔接种至96孔细胞培养板，常规培养。分别于0、12、24、48和72 h收集细胞，加入10 μL CCK-8液，37 ℃孵育2 h，用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度，利用GraphPad Prism 8软件绘制细胞生长曲线。

1.3.6 预后评价计算总生存期（overall survival，OS），总生存期指ESCC患者从手术至死亡或最后一次随访的时间（失访患者）。

1.4 统计学方法应用SPSS 25.0进行统计分析。计数资料采用χ2检验或Fisher确切概率法分析，计量资料采用独立样本t检验进行比较，生存分析采用Kaplan-Meier法。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 DLEU1 在ESCC 中的表达及其与临床病理特征的关系RT-qPCR示，DLEU1在ESCC中的相对表达量显著高于癌旁组织，表达量分别为（3.156±0.622）和（1.638 ± 0.355），两组比较差异有统计学意义（t=14.35，P ＜0.001），见图1。ESCC中DLEU1相对表达量的中位数为3.192，定义DLEU1表达量＜3.192为低表达，3.192为高表达。ESCC组织中DLEU1的相对表达与淋巴结转移（P=0.023）和TNM分期（P=0.047）相关，而与患者的年龄、性别、肿瘤分化程度和浸润深度均无关（P ＞0.05），见表1。

2.2 DLEU1 的表达与ESCC 患者预后的关系生存分析示，DLEU1高表达患者OS较低表达患者明显缩短，两组间比较差异有统计学意义（χ2 =4.672，P=0.031），见图2。

图1 RT-qPCR 示ESCC 中DLEU1 的相对表达量显著高于癌旁组织Fig.1 RT-qPCR showed that the expression of DLEU1 in ESCC tissues was significantly higher than that in adjacent tissues

表1 DLEU1 表达与ESCC 患者临床病理特征的关系Tab.1 Relationships between DLEU1 expression and clinicopathological characteristics of ESCC patients 例

图2 DLEU1 高表达与低表达ESCC 患者生存曲线图Fig.2 Survival curves of ESCC patients with high and low expression of DLEU1

2.3 干扰DLEU1表达对TE-13细胞增殖的影响ECA109、EC9706和TE-13细 胞中DLEU1的相 对表达量分别为（1.610 ± 0.141）、（1.691 ± 0.104）和（2.552 ± 0.103），TE-13的DLEU1表达量较高。本研究采用DLEU1 siRNA质粒转染TE-13细胞，干扰DLEU1的表达。RT-qPCR筛选干扰效率最高的siRNA，结果表明DLEU1 siRNA3转染组的DLEU1表达水平最低，干扰效率最高（图3），后续采用DLEU1 siRNA3进行研究。分别取对照组和干扰组细胞进行CCK-8实验，干扰后48 h对照组的吸光度值（1.130 ± 0.122）高于干扰组（0.696 ± 0.099）（P=0.009），72 h对照组的吸光度值（1.979±0.196）高于干扰组（1.049 ± 0.136）（P = 0.003），表明干扰DLEU1表达能抑制TE-13细胞的增殖（图4）。

图3 RT-qPCR 示siRNA3 转染组干扰效率最高Fig.3 RT-qPCR detection showed that siRNA3 group had the highest interference efficiency

图4 CCK-8 实验表明，干扰DLEU1 表达可以抑制TE-13细胞的增殖Fig.4 CCK-8 assay showed that interference with DLEU1 expression could inhibit the proliferation of TE-13 cells

2.4 干扰DLEU1 表达对TE-13 细胞迁移、侵袭的影响用Image J软件计算划痕后愈合面积百分比，结果显示，划痕24 h后，对照组的愈合面积为（47.23±6.10）%，干扰组愈合面积为（22.97±4.10）%，干扰组细胞愈合速度显著慢于对照组（t = 5.714，P = 0.004），表明干扰DLEU1表达可以抑制TE-13细胞的迁移（图5）。Transwell侵袭试验显示，干扰组和对照组的穿膜细胞数分别为（164.0±22.6）个和（246.3 ± 44.0）个，干扰组较对照组穿膜细胞数显著减少，差异有统计学意义（t=2.882，P=0.045），表明干扰DLEU1表达可以抑制TE-13细胞的侵袭（图6）。

3 讨论

图5 划痕实验示干扰DLEU1 表达可以抑制TE-13 细胞的迁移（×200）Fig.5 Wound healing assay showed that knowdown of DLEU1could inhibit the migration of TE-13 cells（×200）

图6 Transwell 侵袭实验示干扰DLEU1 表达可以抑制TE-13 细胞的侵袭（×200）Fig.6 Transwell invasion assay showed that knowdown of DLEU1 could inhibit the invasion of TE-13 cells（×200）

食管癌是高发恶性肿瘤之一，全球近一半的食管癌新发病例和死亡病例发生在我国，与欧美国家食管癌病理类型以腺癌为主不同，我国的食管癌90%以上为鳞癌［9-10］。尽管采取手术、放化疗、靶向及免疫治疗等综合治疗手段，但是食管癌的预后并未能得到明显改善，很多患者仍死于肿瘤的复发与转移，食管癌的总体5年生存率＜20%［11-12］。越来越多的研究［13-15］表明lncRNA的表达异常与食管癌的发生发展密切相关，lncRNA有可能成为食管癌诊断和预后监测的有效标志物和治疗靶点。

研究［16-19］发现lncRNA DLEU1在肝癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中表达上调，并与预后相关，有可能成为新的诊断标志物及预后预测指标。在肝癌中的研究［16］发现，DLEU1在肝癌组织中表达明显上调，并与更晚的临床分期、血行转移和不良预后密切相关。在直肠癌中的研究［20］发现，DLEU1在直肠癌肿瘤组织中较邻近组织表达上调，并与患者的不良预后相关。本研究发现，DLEU1在ESCC肿瘤组织中的表达较癌旁正常组织中明显升高，并且在ESCC细胞株TE-13中也发现DLEU1的表达水平升高，提示DLEU1参与了ESCC的发生和发展过程。本研究还发现，DLEU1的表达与淋巴结转移、更晚的临床分期相关，DLEU1在低分化患者中高表达比例（64.7%）高于高中分化患者（42.4%），T3+T4患者中高表达比例（58.1%）高于T1+T2患者（36.8%），但经检验差异无统计学意义，可能与本研究入组病例较少有关，研究结果表明DLEU1高表达提示患者预后不良，同时生存分析也提示DLEU1高表达患者生存时间明显缩短，DLEU1表达水平上调可能是ESCC患者预后不良的标志。DLEU1有可能成为ESCC诊断及预后预测的分子标志物。

研究还发现DLEU1参与了肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡等许多重要的生物学过程，在肿瘤发生过程中发挥了类似癌基因的作用。在胃癌中的研究［21］发现，上调DLEU1可以促进胃癌细胞的增殖，而干扰表达则可以明显抑制胃癌细胞的增殖能力，引起细胞周期阻滞，导致凋亡，DLEU1还可以通过对赖氨酸特异性去甲基化酶1启动子的调节来调控转录。在非小细胞肺癌中的研究［22］发现，DLEU1的高表达促进了肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，并通过上调CDK1的表达抑制肿瘤细胞凋亡，动物实验也证实DLEU1的过表达能促进肿瘤的生长。本研究发现干扰DLEU1的表达可以抑制TE-13细胞的增殖、迁移和侵袭，DLEU1有可能成为ESCC治疗的潜在靶点。但是DLEU1对ESCC细胞生物学行为的影响及相关机制，仍有待进一步的研究。

综上所述，本研究发现lncRNA DLEU1在ESCC中表达上调，并与不良预后相关，DLEU1对食管鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭可能具有调节作用，有可能成为ESCC治疗的潜在靶点。