miR-29a靶向信号转导及转录激活因子3调控炎症反应在脂多糖诱导大鼠肾小管上皮细胞损伤中的保护作用

王佳 林雪容 高恒波 张志斌

1河北北方学院附属第一医院急诊科（河北张家口075000）；2河北医科大学第二医院急诊科（石家庄050000）

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是脓毒症常见的合并症，会加重脓毒症病情、增加病死率［1-2］。相关研究认为，急性肾小管上皮细胞损伤是脓毒症致AKI主要的病理生理改变［3-5］，但脓毒症发病过程中肾小管上皮细胞损伤的调控机制尚不明确。Janus激酶2（janus kinase 2，JAK2）/信号转导及转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路是参与炎症及凋亡调控的重要信号通路［6-7］，LEVENTHAL等［8］的动物实验证实，注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）建立脓毒症小鼠模型后，肾脏中STAT3显著激活，表明脓毒症发病过程中肾小管上皮细胞的凋亡可能与JAK2/STAT3通路的激活有关。

微小RNA（microRNA，miR）是近年来在重症医学研究领域受到越来越多重视的一类非编码小分子RNA，具有广泛的生物学作用。miR调控STAT3的研究表明，miR-29a靶向抑制STAT3的表达［9-10］；脓毒症相关的动物实验［11-12］表明，脓毒症大鼠miR-29a表达减少且与肾损伤、心肌损害有关。以上结果表明，miR-29a表达减少可能与脓毒症引起的脏器损伤有关，且靶向STAT3可能是miR-29a参与脓毒症病程中脏器损伤的机制。本研究将以大鼠肾小管上皮细胞株NRK-52E为实验对象，具体分析miR-29a靶向STAT3调控炎症反应在LPS诱导肾小管上皮细胞损伤中的作用，旨在为阐明脓毒症发病过程中肾小管上皮细胞损伤的调控机制、发现脓毒症导致AKI新的治疗手段提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞大鼠肾小管上皮细胞株NRK-52E购自宁波明舟生物科技有限公司。

1.1.2 试剂miR-29a、miR-阴性对照（NC）由上海吉玛公司设计并合成；STAT3抑制剂AG490购自MCE公司；空白的pcDNA3.1质粒及表达STAT3的pcDNA3.1质粒由上海生工公司设计并提供；STAT3基因mRNA 3′UTR的双荧光素酶报告基因质粒由广州云舟生物公司设计并合成；转染试剂Lipofectamine2000为 美 国Thermo公 司；miRNA提取试剂盒、miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRNA荧光定量PCR检测试剂盒购自北京天根公司；MTS细胞活力检测试剂盒、双荧光素酶报告基因检测系统购自Promega公司；STAT3、p-STAT3、Bcl-2的抗体为Abcam公司。TNF-α、IL-1β的酶联免疫吸附法（Elisa）试剂盒为上海西唐公司。

1.1.3 仪器离心机、细胞培养箱为Thermo公司，荧光定量PCR仪为Bio-rad公司，多功能酶标仪为Bio-tek公司，电泳仪及凝胶成像系统为上海天能公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养NRK-52E细胞复苏后在含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中贴壁培养，每2天更换1次完全培养基，待贴壁生长的细胞密度达到90%后用0.25%胰蛋白酶进行消化，按照1∶3的比例传代并继续培养。

1.2.2 细胞分组处理细胞分组处理的实验分为3部分。第一部分实验分4组：（1）对照组；（2）LPS组：用含有1 μg/L LPS的培养基处理；（3）LPS+miR-NC组：转染miR-NC，同时加入LPS使终浓度达到1 μg/L；（4）LPS+miR-29a组：转染miR-29a，同时加入LPS使终浓度达到1 μg/L。第二部分实验分4组：（1）对照组；（2）LPS组：同前；（3）LPS+AG490组：用含有1 μg/L LPS及20 μmol/L AG490的培养基处理；（4）AG490组：用含有20 μmol/L AG490的培养基处理。第三部分实验分5组：（1）对照组；（2）pcDNA3.1组：转染pcDNA3.1质粒；（3）pcDNA3.1+LPS组：转染pcDNA3.1质粒，同时加入LPS使终浓度达到1 μg/L；（4）pcDNA3.1+miR-29a+LPS组：转染pcDNA3.1质粒和miR-29a，同时加入LPS使终浓度达到1 μg/L；（5）pcDNA3.1-STAT3+miR-29a+LPS组：转 染pcDNA3.1-STAT3质粒 和miR-29a，同时加入LPS使终浓度达到1 μg/L。

第一和第三部分的转染实验均使用Lipofectamine2000，按照转染试剂说明书进行操作。

1.2.3 miR-29a 表达水平检测NRK-52E细胞接种在12孔板内，按照1.2.2的方法分组干预24 h后，采用miRNA提取试剂盒分离miRNA，按照miRNA cDNA第一链合成试剂盒操作、将miRNA反转录为cDNA，按照miRNA荧光定量PCR检测试剂盒配置反应体系、对miR-29a及U6进行PCR反应，PCR程序为：95 ℃预变性3 min、95 ℃15 s及60 ℃34 s重复40个循环，软件中生成PCR循环曲线及循环阈值（Ct），根据公式2-ΔΔCt计算miR-29a的表达量。

1.2.4 细胞活力的MTS 法检测NRK-52E细胞接种在96孔板内，按照1.2.2的方法分组干预24 h后，采用MTS试剂盒检测细胞活力，将试剂盒内的检测液加入培养孔、20 μL/孔，继续培养4 h后在多功能酶标仪上检测490 nm波长的吸光度、为A490。

1.2.5 蛋白表达的Western blot 检测NRK-52E细胞接种在12孔板内，按照1.2.2的方法分组干预24 h后，用RIPA裂解液裂解细胞、提取蛋白，BCA试剂盒测定蛋白含量，根据测定结果取含有30 μg蛋白的样本进行Western blot检测，电泳、电转膜、封闭、孵育一抗、孵育二抗后在凝胶成像系统中曝光得到蛋白条带，根据条带的灰度值、以β-actin为内参计算STAT3、p-STAT3、Bcl-2的表达水平。

1.2.6 细胞因子的Elisa 检测NRK-52E细胞接种在12孔板内，按照1.2.2的方法分组干预24 h后，取培养基并采用Elisa试剂盒检测TNF-α、IL-1β的含量，提取细胞中的蛋白并采用BCA试剂盒检测蛋白含量，计算每毫克细胞蛋白对应的培养基TNF-α、IL-1β含量。

1.2.7 双荧光素酶报告基因实验NRK-52E细胞接种在24孔板内，将双荧光素酶报告基因质粒及miR-181mimic或NC mimic共同转染进入细胞，24 h后保留细胞，采用双荧光素酶报告基因检测系统分别检测萤火虫荧光活力及海肾荧光活力，计算萤火虫荧光活力/海肾荧光活力的比值，以该比值作为双荧光素酶报告基因的荧光素酶活力。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0软件录入数据，计量资料以均数±标准差表示，多组间的比较采用方差分析，有统计学差异的资料进一步进行LSD-t两两比较，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-29a 对NRK-52E 细胞活力的影响与对照组比较，LPS组NRK-52E细胞的miR-29a表达水平及A490水平均明显降低（P ＜0.05）；与LPS组比较，LPS+miR-NC组NRK-52E细胞的miR-29a表达水平及A490水平无明显变化（P ＞0.05），LPS+miR-29a组NRK-52E细胞的miR-29a表达水平及A490水平均明显增加（P ＜0.05）。见表1。

2.2 miR-29a 对NRK-52E 细胞STAT3 途径的影响与对照组比较，LPS组STAT3、p-STAT3的表达水平及TNF-α、IL-1β的含量均明显增加，Bcl-2的表达水平明显降低（P ＜0.05）；与LPS组比较，LPS+miR-NC组STAT3、p-STAT3、Bcl-2的表达水平及TNF-α、IL-1β的含量无明显变化（P ＞0.05），LPS+miR-29a组STAT3、p-STAT3的表达水平及TNF-α、IL-1β的含量均明显降低，Bcl-2的表达水平明显增加（P ＜0.05）。见图1、表2。

表1 miR-29a 对NRK-52E 细 胞miR-29a 及A490 水 平 的影响Tab.1 Effect of miR-29a on miR-29a and A490 levels of NRK-52E cells ±s

表1 miR-29a 对NRK-52E 细 胞miR-29a 及A490 水 平 的影响Tab.1 Effect of miR-29a on miR-29a and A490 levels of NRK-52E cells ±s

注：与对照组比较，*P ＜0.05；与LPS 组比较，#P ＜0.05

组别对照组LPS 组LPS+miR-NC 组LPS+miR-29a 组例数5 5 5 5 miR-29a 0.83±0.16 0.39±0.09*0.41±0.08 1.21±0.29#A490 1.02±0.24 0.45±0.09*0.50±0.01 0.95±0.20#

图1 转染miR-29a 后NRK-52E 细胞中STAT3、p-STAT3、Bcl-2 的蛋白条带Fig.1 Protein bands of STAT3，p-STAT3 and Bcl-2 in NRK-52E cells after miR-29a transfection

表2 miR-29a 对NRK-52E 细胞中STAT3、p-STAT3、Bcl-2 表达及培养基中TNF-α、IL-1β含量的影响Tab.2 Effect of miR-29a on STAT3，p-STAT3，bcl-2 expression in NRK-52E cells and TNF-α，IL-1 β content in culture medium ±s

表2 miR-29a 对NRK-52E 细胞中STAT3、p-STAT3、Bcl-2 表达及培养基中TNF-α、IL-1β含量的影响Tab.2 Effect of miR-29a on STAT3，p-STAT3，bcl-2 expression in NRK-52E cells and TNF-α，IL-1 β content in culture medium ±s

注：与对照组比较，*P ＜0.05；与LPS 组比较，#P ＜0.05

组别对照组LPS 组LPS+miR-NC 组LPS+miR-29a 组例数5 5 5 5 STAT3（/β-actin）0.40±0.08 0.84±0.20*0.81±0.23 0.32±0.09#p-STAT3（/β-actin）0.28±0.05 0.60±0.13*0.67±0.14 0.41±0.09#Bcl-2（/β-actin）0.88±0.21 0.40±0.08*0.42±0.09 0.85±0.22#TNF-α（pg/mgPro）1.83±0.42 6.58±1.24*6.61±1.33 3.04±0.67#IL-1β（pg/mgPro）1.09±0.32 4.42±0.75*4.77±0.91 2.14±0.46#

2.3 miR-29a靶向STAT3基因mRNA 3′UTR的验证经Targetscan的生物信息学分析，miR-29a靶向STAT3基因mRNA 3′UTR第1011-1017碱 基，见图2A；经双荧光素酶报告基因实验，miR-29a组野生型STAT3基因双荧光素酶报告基因的荧光活力低于miR-NC组（P ＜0.05），突变型STAT3基因双荧光素酶报告基因的荧光活力与对照组比较无差异（P ＞0.05），见图2B。

2.4 STAT3抑制剂对NRK-52E细胞活力及STAT3途径的影响与对照组比较，LPS组各项指标差异均有统计学意义（P ＜0.05），AG490组各项指标均无明显变化（P ＞0.05）；与LPS组比较，LPS+AG490组A490水平及Bcl-2的表达水平均明显增加，STAT3、p-STAT3的表达水平及TNF-α、IL-1β的含量均明显减少（P ＜0.05），STAT3的表达水平无明显变化（P ＞0.05）。见图3、表3。

图2 miR-29a 靶向STAT3 基因mRNA 的3′UTRFig.2 miR-29a target 3′UTR of STAT3 gene mRNA

图3 加用AG490 后NRK-52E 细胞中STAT3、p-STAT3、Bcl-2 的蛋白条带Fig.3 Protein bands of STAT3，p-STAT3 and Bcl-2 in NRK-52E cells after AG4 90 intervention

2.5 过表达STAT3对miR-29a减轻LPS诱导NRK-52E 细胞损伤的影响与pcDNA3.1组比较，pcDNA3.1+LPS组各项指标均有显著变化（P ＜0.05）；与pcDNA3.1+LPS组比较，pcDNA3.1+LPS+miR-29a组各项指标均明显改善（P ＜0.05）；与pcDNA3.1+LPS+miR-29a组比较，pcDNA3.1-STAT3+LPS+miR-29a组A490水平及Bcl-2的表达水平均明显降低，STAT3、p-STAT3的表达水平及TNF-α、IL-1β的含量均明显增加（P ＜0.05）。见图4、表4。

表3 STAT3 抑制剂对NRK-52E 细胞A490 水平、STAT3、p-STAT3 及Bcl-2 表达、TNF-α及IL-1β含量的影响Tab.3 Effects of STAT3 inhibitor on A490 level，STAT3，p-STAT3 and bcl-2 expression，TNF-α and IL-1β content of NRK-52E cells ±s

表3 STAT3 抑制剂对NRK-52E 细胞A490 水平、STAT3、p-STAT3 及Bcl-2 表达、TNF-α及IL-1β含量的影响Tab.3 Effects of STAT3 inhibitor on A490 level，STAT3，p-STAT3 and bcl-2 expression，TNF-α and IL-1β content of NRK-52E cells ±s

注：与对照组比较，*P ＜0.05；与LPS 组比较，#P ＜0.05

组别对照组LPS 组LPS+AG490 组AG490 组例数5 5 5 5 A490 1.07±0.25 0.42±0.08*0.91±0.27#1.10±0.24 STAT3 0.37±0.09 0.89±0.21*0.84±0.24#0.30±0.08 p-STAT3 0.25±0.06 0.69±0.14*0.34±0.08#0.31±0.08 Bcl-2 0.95±0.23 0.42±0.07*0.99±0.25#0.87±0.20 TNF-α 1.69±0.31 6.22±1.41*2.62±0.42#1.84±0.27 IL-1β 1.02±0.34 4.89±0.81*2.18±0.44#1.28±0.36

3 讨论

AKI是脓毒症常见的合并症，也是影响脓毒症预后、增加疾病救治难度及病死率的重要原因［13-16］。近些年YE等［3］、ZHENG等［4］、张泽英等［5］、等多项研究表明，LPS诱导肾小管上皮细胞损伤是脓毒症引起AKI的重要因素，但细胞损伤的具体调控机制尚不十分清除。MiR-29a与脓毒症脏器损伤有关，多项动物实验发现，脓毒症模型大鼠肾脏及心肌中miR-29a的表达均明显减少［11-12］；ZHANG等［11］的细胞实验发现，LPS刺激NRK-52E细胞能够抑制miR-29a的表达。本实验采用与SONG等［12］相同的方法用LPS刺激NRK-52E细胞并发现miR-29a表达减少。同时，本实验还观察到：LPS刺激NRK-52E细胞后细胞活力降低、表明细胞发生损伤。在此基础上，本实验将深入探究miR-29a在LPS引起NRK-52E细胞损伤中的具体作用及机制。

图4 过表达STAT3 后NRK-52E 细胞中STAT3、p-STAT3、Bcl-2 的蛋白条带Fig.4 Protein bands of STAT3，p-STAT3 and Bcl-2 in NRK-52E cells after overexpression of STAT3

在脓毒症及类风湿性关节炎的研究中，miR-29a分别靶向抑制单核细胞及滑膜细胞中的STAT3，进而抑制炎症反应的激活［9-10］。STAT3是促进炎症反应放大及细胞凋亡激活的重要信号分子［17-19］，在LPS诱导肾小球内皮细胞损伤、脓毒症急性肺损伤大鼠及缺氧复氧诱导肾小管上皮细胞损伤的模型中，p-STAT3的表达均明显增加，同时下游促炎细胞因子TNF-α及IL-1β释放增多、抗凋亡基因Bcl-2表达下调［20-22］。本实验观察到：LPS刺激NRK-52E细胞后，STAT3、p-STAT3的表达及TNF-α、IL-1β的含量均增加，而Bcl-2的表达减少；加用STAT3抑制剂AG490后，LPS诱导肾小管上皮细胞的损伤明显减轻。以上结果表明在LPS诱导肾小管上皮细胞损伤的过程中，STAT3表达增加及过度激活起重要作用。

表4 过表达STAT3 对miR-29a 调控NRK-52E 细胞A490 水平、STAT3、p-STAT3 及Bcl-2 表达、TNF-α及IL-1β含量的影响Tab.4 Effects of overexpression of STAT3 on miR-29a regulating A490 level，STAT3，p-STAT3 and bcl-2 expression，TNF-α and IL-1 β content in NRK-52E cells ±s

表4 过表达STAT3 对miR-29a 调控NRK-52E 细胞A490 水平、STAT3、p-STAT3 及Bcl-2 表达、TNF-α及IL-1β含量的影响Tab.4 Effects of overexpression of STAT3 on miR-29a regulating A490 level，STAT3，p-STAT3 and bcl-2 expression，TNF-α and IL-1 β content in NRK-52E cells ±s

注：与pcDNA3.1 组比较，*P ＜0.05；与pcDNA3.1+LPS 组比较，#P ＜0.05；与pcDNA3.1+LPS+miR-29a 组比较，&P ＜0.05

组别对照组pcDNA3.1 组pcDNA3.1+LPS 组pcDNA3.1+LPS+miR-29a 组pcDNA3.1-STAT3+LPS+miR-29a 组例数5 5 5 5 5 A490 1.04±0.25 1.07±0.29 0.45±0.09*0.94±0.21#0.42±0.08&STAT3 0.39±0.08 0.35±0.09 0.82±0.20*0.29±0.07#0.79±0.13&p-STAT3 0.26±0.06 0.24±0.07 0.74±0.12*0.24±0.05#0.70±0.15&Bcl-2 0.88±0.14 0.84±0.17 0.40±0.09*0.95±0.16#0.55±0.07&TNF-α 1.59±0.25 1.66±0.28 6.11±1.32*3.08±0.62#6.52±1.44&IL-1β 1.04±0.27 1.08±0.31 4.58±0.95*2.28±0.52#4.29±0.88&

LPS能够抑制miR-29a表达、增 加STAT3表达，由此推测LPS可能通过miR-29a增加STAT3表达并引起肾小管上皮细胞损伤。为了验证上述推测，本实验在过表达miR-29a后观察到LPS诱导肾小管上皮细胞的损伤明显减轻、STAT3表达明显减少，且经双荧光素酶报告实验验证发现miR-29a靶向STAT3基因mRNA的3′UTR，表明miR-29a在LPS诱导肾小管上皮细胞损伤中起保护作用且能靶向抑制STAT3。在此基础上，通过转染STAT3表达质粒进行验证，在LPS刺激并转染miR-29a的同时过表达STAT3后观察到miR-29a增加细胞活力及bcl-2表达、减少TNF-α及IL-1β含量的作用均明显减弱，由此证实了miR-29a减轻LPS诱导肾小管上皮细胞损伤的作用与抑制STAT3的表达及激活有关。

综上所述，本实验的结果表明，在LPS诱导肾小管上皮细胞损伤的过程中，miR-29a表达减少、STAT3的表达增加及激活过度，下游抗凋亡基因Bcl-2表达减少、促炎因子TNF-α及IL-1β释放增加；miR-29a能靶向抑制STAT3并在LPS诱导肾小管上皮细胞损伤中发挥保护作用。未来，miR-29a/STAT3轴有望成为研究脓毒症引起AKI发病机制的靶点，也能为研究脓毒症合并AKI的治疗提供新思路。