成纤维细胞活化蛋白对眼睑基底细胞癌相关成纤维细胞增殖及凋亡的影响及机制研究

杨夏 张西 龙秋蓉

贵州医科大学附属医院眼科（贵阳550004）

眼睑基底细胞癌是眼睑常见恶性肿瘤，常发生于表皮基底细胞或皮肤附属器，发病缓慢，恶性程度和转移程度较低，但可侵袭性破坏局部组织，影响患者眼部功能和面部外观［1-2］。肿瘤微环境包括肿瘤周围基质细胞及其分泌的细胞因子、趋化因子等，这些因素之间相互作用及信号转导在肿瘤细胞生长过程中发挥关键作用［3］。成纤维细胞是最主要的基质细胞，在机体处于损伤、炎症或肿瘤状态下被激活，癌相关成纤维细胞（carcinomaassociated fibroblasts，CAFs）是肿瘤间质活化的成纤维细胞，具有成纤维细胞和平滑肌细胞共同特征，能为上皮细胞转化提供促癌信号，在血管生成及肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭过程中发挥重要作用［4-5］。成纤维细胞活化蛋白（fibroblast activation protein，FAP）是成纤维细胞活化后特异性表达的标志物，可增强肿瘤细胞侵袭力，促进肿瘤生长和增殖［6］。第10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失的基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN）是一种抑癌基因，主要通过抑制磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidyl inositol-3-kinase，PI3K）/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（serine-threonine protein kinase，AKT）通路在多种肿瘤组织中发挥抑癌作用［7］。既往人们对眼睑基底细胞癌的研究多集中于癌细胞本身，对基质成纤维细胞关注较少，眼睑基底细胞癌细胞学特征提示，CAFs可能与其发生发展过程有关，目前相关报道尚少，本研究通过分离、培养人眼睑基底细胞癌CAFs，探讨FAP对其细胞增殖和凋亡的影响及可能作用机制，旨在为临床治疗眼睑基底细胞癌提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源选择2018年6月至2019年8月期间本院收治的眼睑基底细胞癌患者4例以及3例行上睑皮肤松弛矫正术患者作为研究对象，患者均接受手术治疗，收集手术切除组织，术后经病理学鉴定为眼睑基底细胞癌和正常眼睑皮肤。本研究经医院伦理委员会审批通过，研究获得患者同意并签署知情同意书。

1.1.2 主要试剂FAP过表达、FAP shRNA及随机序列shRNA慢病毒载体pLKO.1（美国Open biosystem公司），细胞凋亡检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司），鼠抗人细胞角蛋白（cytokeratin，CK）单抗、鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）单抗、兔抗人波形蛋白（vimentin，VIM）单抗、兔抗人FAP多抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），PTEN抑制剂bpv、兔抗人PTEN多抗、PI3K单抗、p-PI3K单抗、AKT多抗、p-AKT多抗（美国Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞分离、培养将眼睑基底细胞癌和正常眼睑皮肤组织置于无菌条件下，PBS冲洗干净，剪去多余上皮和脂肪组织，用眼科剪将剩余组织剪碎，平铺于培养瓶中，加入DMEM培养基，于体积分数5%CO2，37 ℃培养箱内培养，2 ～3 d换液1次。获得眼睑CAFs和正常成纤维细胞（normal fibroblasts，NFs），于显微镜下观察细胞形态。

1.2.2 细胞鉴定细胞培养到第3代，制作细胞爬片，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤；加入1%Triton X-100，室温孵育5 min，PBS洗涤；3% H2O2封闭10 min，PBS洗涤；山羊血清封闭15 min；滴加1∶100稀释的CK、α-SMA、VIM、FAP一抗（以PBS代替一抗作为阴性对照），4 ℃孵育过夜，PBS洗涤；滴加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗涤；滴加DAB显色，自来水冲洗；苏木素复染，封片，显微镜下观察，细胞质中出现棕色颗粒判定为阳性。

1.2.3 细胞分组及干预取对数生长期第3代纯化的眼睑CAFs随机分为对照组、过表达组、敲降组、空载组、抑制剂组，过表达组、敲降组、空载组细胞分别用含有FAP、FAP shRNA、空载随机序列慢病毒转染，抑制剂组转染含有FAP shRNA的慢病毒，同时培养基中加入250 nmol/L的bpv，对照组不做转染处理。48 h后，荧光显微镜下观察转染效率，均＞85%，可用于后续实验。

1.2.4 眼睑CAFs 增殖检测各组细胞以1.0×104个/孔浓度接种于96孔板，每组设置5个复孔，置于体积分数5% CO2，37 ℃培养箱内分别培养24、48、72 h，每个时间点结束前4 h按20 μL/孔加入0.5 mg/mL的MTT溶液，继续孵育4 h，弃上清，按150 μL/孔加入DMSO，震荡10 min，以充分溶解结晶，使用酶标仪在490 nm处读取各孔吸光度（A）值，以空白孔为对照，记录数据，绘制生长曲线。

1.2.5 眼睑CAFs 凋亡检测各组细胞，PBS洗涤2次，1 000 r/min（离心半径8 cm）离心5 min，加入Binding buffer重悬细胞，加入5 μL AnnexinV-FITC避光条件下4 ℃孵育15 min，加入10 μL PI核酸染料染色5 min，上流式细胞仪，检测细胞凋亡情况。

1.2.6 眼睑CAFs FAP、PTEN、PI3K、Akt、p-Akt蛋白水平检测细胞加入RIPA裂解液，离心取上清，BCA法定量，配制蛋白样品，100 ℃水浴变性，进行SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，加入FAP、PTEN、PI3K、Akt、p-Akt（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，加入HRP耦连的二抗（1∶5 000），室温孵育2 h，TBST洗膜，加入ECL发光液，曝光显影，计算目的蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法采用SPSS 25.0统计学软件分析数据，计量资料以均数±标准差表示，多样本计量资料比较采用单因素方差分析，两两样本比较采用LSD-t检验。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态学观察倒置显微镜下可见：眼睑CAFs呈长梭形，细胞大小不一，数量较多，生长速度快，排列紊乱，丧失密度抑制和接触抑制；NFs呈扁平状，细胞大小接近，细胞数量较少，生长速度慢，排列规则，无重叠生长。见图1。

图1 细胞形态Fig.1 Cell morphology

2.2 眼睑CAFs 鉴定CAFs和NFs均不表达CK，均表达VIM阳性；CAFs表达α-SMA、FAP阳性，NFs表达α-SMA、FAP阴性。见图2。

图2 免疫组化染色（SP×200）Fig.2 Immunohistochemical staining（SP×200）

2.3 眼睑CAFs 增殖情况与对照组、空载组比较，过表达组24、48、72 h MTT实验A值增大，敲降组及抑制剂组24、48、72 h MTT实验A值减小（P ＜0.05）；抑制剂组24、48、72 h MTT实验A值大于敲降组（P ＜0.05）。见图3。

2.4 眼睑CAFs 凋亡情况与对照组、空载组比较，过表达组凋亡率降低，敲降组、抑制剂组凋亡率升高（P ＜0.05）；抑制剂组凋亡率低于敲降组（P ＜0.05）。见图4。

2.5 眼睑CAFs FAP、PTEN、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表达与对照组、空载组比较，过表达组FAP、p-PI3K、p-Akt表达升高，PTEN表达降低，敲降组、抑制剂组FAP、p-PI3K、p-Akt表达降低，PTEN表达升高（P ＜0.05）；抑制剂组PTEN表达低于敲降组，p-PI3K、p-Akt高于敲降组（P ＜0.05）。见图5。

图3 CAFs 生长曲线Fig.3 CAFs growth curve

图4 细胞凋亡率比较Fig.4 Comparison of apoptosis rates

图5 细胞中蛋白表达Fig.5 Expression levels of various proteins in cells

3 讨论

眼睑基底细胞癌病因复杂，与放射线、紫外线、砷制剂、遗传等因素有关，临床治疗以手术切除为主，部分患者术后存在局部复发现象，放射治疗可减少术后复发率，但易引起放射性角膜炎、白内障等其他眼部并发症［8］。CAFs是肿瘤微环境中最丰富的细胞，其标志着细胞间质被激活，FAP在多数上皮细胞癌CAFs和部分肿瘤细胞间质中高表达，与血管生成、肿瘤增殖及细胞外基质侵袭、重塑之间关系密切，研究FAP对CAFs增殖、凋亡等生物学特征的影响，对治疗眼睑基底细胞癌有重要临床意义［9］。

本研究成功培养出眼睑CAFs和NFs，显微镜下CAFs与NFs形态上差异显CAFs丧失接触抑制和密度抑制。CAFs与NFs同属于成纤维细胞，均不表达上皮细胞标志物CK，表达成纤维细胞标志物VIM，同时CAFs还可特异性表达α-SMA和FAP，既往研究均已证实α-SMA和FAP在NFs中不表达或极低表达，免疫组化方法无法检出［10］。本研究经免疫组化染色，结果显示，CAFs除表达CK阴性外，VIM、α-SMA和FAP均表达阳性，而NFs只有VIM表达阳性。研究显示，来源口腔癌、前列腺癌的CAFs表达α-SMA和FAP阳性［11］，本研究与其他肿瘤来源CAFs特性一致，成功分离纯化CAFs，并与NFs作出区别，进一步研究其增殖、凋亡情况。

肿瘤微环境中基质细胞功能变化会影响肿瘤细胞恶性生物潜能，癌组织中成纤维细胞CAFs能提高肿瘤细胞免疫力和抵抗力。FAP是CAFs活化的特异性标志物，在正常成纤维组织中不表达，在卵巢癌、乳腺癌等上皮恶性肿瘤的基质成纤维细胞中高表达，可以促进成纤维细胞增殖，改变肿瘤微环境，激活邻近上皮细胞内增长信号，增加肿瘤细胞恶性表型，参与肿瘤发生发展过程［12-13］。CAFs是肿瘤微环境中主要基质细胞，参与肿瘤细胞外基质合成、降解、分布，并与肿瘤细胞增殖、侵袭等生物学行为密切相关。FAP由CAFs分泌，同时又可以反过来促进CAFs增殖，抑制其凋亡，增加肿瘤微环境中FAP浓度，从而促进肿瘤细胞恶性潜能［14］。表达FAP是CAFs主要特征之一，FAP阳性的间质细胞是肿瘤基质主要成分，FAP促进CAFs增殖，引起FAP分泌增加，且FAP基因组稳定，不易耐药，表面抗原表达稳定，可以作为肿瘤免疫诊治靶分子。本研究过表达组CAFs A值升高，凋亡率下降，通过敲降FAP基因后，A值降低，凋亡率升高，提示过表达FAP促进CAFs增殖，抑制细胞凋亡。

PTEN/PI3K/Akt通路是细胞内重要信号转导通路之一，通路表达异常与糖尿病等多种疾病有关，同时与肿瘤发展有密切关系，在细胞增殖中发挥重要作用［15］。PTEN是一种抑癌基因，在细胞增殖、凋亡等过程中发挥调控作用。PI3K参与多种细胞调控，Akt是PI3K下游靶蛋白，通过调节下游分子目标，抑制细胞凋亡，促进恶性肿瘤发展。PTEN是PI3K/Akt通路重要的负性调节剂，通过去磷酸化PI3K底物，抑制Akt及其下游分子活化，诱导细胞凋亡。研究表明，PTEN/PI3K/Akt信号通路通过阻滞细胞周期，参与诱导小鼠骨髓细胞的凋亡［16］。上调PTEN表达，可负性抑制PI3K/Akt通路，抑制胆管癌细胞增殖［17］。本研究过表达组PTEN表达显著降低，激活PI3K/Akt通路，促进CAFs增殖，抑制其凋亡，敲降FAP基因后，PTEN表达升高，阻滞PI3K/Akt通路，减少CAFs增殖，在敲降FAP基因基础上加入PTEN抑制剂，可促进CAFs增殖，提示过表达FAP通过调节PTEN/PI3K/Akt信号通路促进CAFs增殖，抑制其凋亡。PTEN在多种肿瘤或癌相关成纤维组织中低表达，通过激活PI3K/Akt通路促进细胞增殖［18］。PTEN促进CAFs增殖并抑制其凋亡，引起肿瘤微环境失衡，从而影响肿瘤细胞或癌细胞恶性生物学行为。

综上所述，过表达FAP可能通过调控PTEN/PI3K/Akt信号通路促进眼睑CAFs增殖，抑制其凋亡，显示出其诊断治疗眼睑基底细胞癌的潜能，FAP对眼睑CAFs侵袭及迁移作用还需进一步研究，可能为临床提供新靶点。