油茶皂素定量分析方法研究进展

王羚 ，方学智

1. 中国林业科学院亚热带林业研究所（杭州 311400）；2. 中南林业科技大学食品科学与工程学院（长沙 410004）

茶皂素（Tea saponin）又称茶皂苷，是广泛存在于山茶属植物中的一类三萜类糖苷化合物，其基本结构是由苷元、糖体和有机酸3部分组成。油茶（Camellia oleiferaAbel.）为山茶科（Theaceae）山茶属植物，种植历史悠久，是我国四大木本油料作物之一。我国油茶资源丰富，2018年油茶种植总面积为6 550万亩（1亩=0.067 hm2），榨油后产生的饼粕中茶皂素含量高达15%[1]。

茶皂素不仅具有良好的表面活性，还具有消炎、镇痛、抗菌、提高免疫力、刺激动物体内激素分泌、抑制酒精吸收等药理作用，被广泛应用于食品、洗涤、纺织、医药等行业。近几年也有使用茶皂素去除重金属、修复土壤等用于环境保护的报道[2]。

茶皂素含量是衡量产品质量的重要指标，但由于其结构的复杂性和多样性，使得定量分析较为困难。但随着科技的发展，检测方法的灵敏度准确度越来越高，研究论述了近年来在油茶皂素定量方面开展的工作，为茶皂素的定量检测方法的进一步开发提供参考。

1 经典检测法

1.1 重量法

茶皂素最常用的定量分析方法是重量法以及比色法。重量法是将茶皂素经酸、碱水解后得到不溶于水的皂苷元，根据皂苷元和皂苷的重量比计算总皂苷含量。朱全芬等[3]采用索氏提取法从油茶饼粕和茶皂素产品中提取茶皂素，以碱式醋酸铅为沉淀剂，在酸性条件下分离得到不溶于水的茶皂苷，从而计算出茶皂素含量。重量法不需要复杂的仪器，但SN/T 1852—2006《出口茶皂素中皂苷含量的测定》中明确指出该方法仅适用于茶皂素质量分数为30%～70%的茶皂素产品，且该方法存在操作复杂、所需时间过长、消耗试剂大等问题。

1.2 比色法

比色法是根据三萜类皂苷的显色反应来确定茶皂素含量的方法，常见的有间苯三酚-乙醇溶液法、香草醛-浓硫酸法、三氯化铁-浓硫酸法等。在传统方法基础上，溴酸钾法、香草醛-高氯酸法、速差分光光度法等新方法也涌现出来。

间苯三酚法也称皂苷糖体定量分析法，根据测定水解前后糖含量之差，间接计算皂苷的含量。间苯三酚法与重量法相比测定速度快，反应较稳定，但消耗试剂大，反应所需时间约3 h，同时可能由于糖体没有完全消除而造成实验误差[4]。

香草醛-浓硫酸作为显色剂对茶皂素进行定量分析的方法灵敏度和准确度均高于重量法。傅春玲等[5]发现香草醛浓度在8%以上、硫酸浓度在72%～82%之间时，测定吸光度基本不变。使用香草醛-浓硫酸法测定茶皂素受试剂影响较大，在室温下长时间放置导致吸光度下降。另外，样品中的黄酮类、酚类物质与茶皂素结构相似，会对定量产生干扰，影响准确度[6]。

孙冀平[7]对香草醛-冰醋酸-高氯酸法、香草醛-冰醋酸-浓硫酸法、香草醛-浓硫酸-乙醇法、香草醛-高氯酸-乙醇法4种方法进行了对比，结果发现香草醛-冰醋酸-高氯酸法效果最好，在温度为60 ℃的条件下反应15 min，显色效果最佳，吸光度随时间变化较大，需30 min之内完成测定，且对三萜类皂苷的反应的灵敏度不及甾体皂苷[8-9]。

三氯化铁-浓硫酸可与茶皂素发生显色反应生成黄绿色化合物，因此可以测定茶皂素含量。此方法与重量法的结果基本一致，重现性较好，且无需对样品进行水解，但对温度较为敏感，需严格控制在60±5 ℃。

溴酸钾法是利用溴与双键的加成反应进行茶皂素的定量。许国水[10]使用溴酸钾法对茶皂素进行定量分析的反应条件进行了研究，反应在20～30 ℃时的溴化率较好，但起始酸度不宜过高，且在滴定时需剧烈振荡，不易操作。

表1 不同比色法的优缺点对比

2 光度法与光谱法

2.1 荧光分光光度法

荧光分光光度法是基于茶皂苷对铝-8-羟基喹啉的荧光有增敏作用，且在一定范围内荧光强度与茶皂苷含量呈线性相关，根据荧光谱线位置及强度进行茶皂素含量检测。荧光分光光度法灵敏度高、操作简便，但荧光分光光度法回收率偏低，测定浓度范围较小，更适合测定微量浓度的茶皂素[12]。

2.2 速差分光光度法

速差分光光度法是利用茶皂素及样品中掺杂的酚类物质分别与FeCl3发生显色反应的速率不同，使用分光光度计直接测定茶皂素含量的方法。刘晓庚等[12]进行了荧光光度法和速差分光光度法对茶皂素定量分析的对比研究，2种测定方法与重量法的测定结果基本一致，速差法的灵敏度稍差，但测量浓度的范围比荧光分光光度法大一些。

2.3 近红外光谱法

近红外光谱法是近年来迅速发展的一种快速分析技术。李刚等[14]使用近红外光谱法对茶皂素的检测进行了研究，结果发现近红外光谱与重量法相比，效率和准确度更高，可在数分钟内对微量样品检测一次即可得到茶皂素、水、含油率等多种数据。

声光可调近红外光谱技术（Acousto-Optic Tunable Filter-Near Infrared，AOTF-NIR）是新兴的一种检测方法。苏婷等[15]应用声光可调近红外光谱技术快速测定人参皂苷含量，此方法与高效液相色谱法检测结果进行对照，偏差仅为3.49%，准确性和重现性也较好[16]。声光可调近红外光谱技术精确度高、建模速度快，但是否能用于茶皂素的检测尚需进一步研究。

3 高效液相色谱法

高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）法是近年来测定茶皂素含量的新方法，因具有操作方便、准确度高且可以测定微量样品而受到关注。

3.1 高效液相-紫外检测器法

高效液相-紫外检测（HPLC-UV）法是目前使用较多的方法。目前报道的茶皂素HPLC大都只分离出一个茶皂素峰，有的文献中虽然分离出了几个峰，但各色谱出峰时间比较集中，保留时间短，分离度低[17]。另外紫外检测器对样品的稳定性要求比较高，被测物质不可无紫外吸收或仅紫外末端吸收。

Toshio等[18]以Inertsil ODS-3（2.1 mm×100 mm，3 μm）作分析柱，以5 mmol/L三氟乙酸的甲醇作流动相，在230 nm处对自制茶皂素进行测定。张海龙等[19]采用C18柱，以水-乙腈对自制茶皂素进行梯度洗脱，在215 nm处进行检测，此方法使得茶皂素样品中的其他成分（如黄酮类物质）对茶皂素的干扰较小，茶皂素的峰形对称。赵敬娟等[6]以水-乙腈作流动相，在209 nm检测波长下对油茶皂苷进行检测，认为该方法重现性准确度高，得到的峰形对称，柱效高、保留时间合适，在茶皂素检测方面准确可靠[20]。

新型仪器法为验证其准确度和灵敏性，常与传统方法进行对比，如陈莹[21]对重量法、香草醛-浓硫酸法和HPLC法进行综合比较，使用3种方法对油茶籽粕、茶皂素粗提物、高纯度茶皂素进行皂苷质量分数的检测（表2），结果显示HPLC法测定的皂苷质量分数稍高于重量法和香草醛-浓硫酸法，HPLC法与香草醛浓硫酸法相比受环境干扰小，操作更简单，试剂消耗少，准确度更高[6]。张团结等[8]用HPLC法和香草醛-高氯酸法2种方法对水解后的茶皂素进行定量，所得结果大致相同。

3.2 高效液相-蒸发光散射法

高效液相-蒸发光散射法是将HPLC系统与蒸发光散射器联用进行检测的方法。蒸发光散射器（ELSD）是一种通用型检测器，可以检测没有紫外吸收的有机物质。目前该方法较多用于中草药皂苷的研究（表3），目前国内外没有相关文献报道用其进行茶皂素的定量检测。

若所测皂苷无紫外吸收或在紫外末端吸收，如果采用HPLC-UV法测定，会对结果有较大影响，造成灵敏度低、重现性差，因此可考虑蒸发光散射器进行检测。一些研究者使用HPLC-ELSD对三萜皂苷进行定量研究，结果发现其检测结果的准确度、重现性都较好。HPLC-ELSD法常使用梯度洗脱，各色谱峰互不干扰，分离较好。上述所研究的皂苷与茶皂素同为三萜类皂苷，具有参考价值，但对于茶皂素的定量检测是否具有指导性的意义需具体研究得出结论。

3.3 超高效液相色谱-串联质谱法

超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）法是将超高效液相色谱与二级质谱的质谱仪串联的一种检测方法，样品通过超高微粒的固定相后分离出来通过MS进行检测。该方法分离度高、快速、准确、灵敏。Foubert等[29]应用高效液相色谱与三重四极杆质谱联用检测Maesa lanceolata中的皂苷，共检测到14种皂苷，与HPLC-UV相比，该方法分析速度快、灵敏度、准确度高。王祁民等[30]建立了UPLC-MS/MS法定量测定通关藤中的皂苷，6 min内即可完成对通关藤药材中通关藤苷A、H、I含量的测定。该方法目前尚未用于油茶皂素的定量分析。

4 薄层扫描法

薄层扫描（Thin-layer chromatography scanning，TLCS）法是用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中有吸收或能产生荧光的斑点进行扫描，通过扫描得到的图谱及积分值来定量茶皂素的方法。田世雄等[31]使用高效薄层板对皂素中的皂苷进行了分离，且在不显色的情况下进行紫外扫描测定，最后利用薄层色谱扫描仪进行定量，得到茶皂素中皂苷类成分含量。

5 研究展望

由于茶皂素结构的相似性和复杂性，茶皂素定量分析和单体的分离研究工作进行得非常困难。茶皂素定量分析不断地取得阶段性的成果，建立出了不少先进的方法，对茶皂素的质量控制和应用具有重要意义。但每种检测方法都各有优缺点，传统方法耗时耗力、准确度低，高效便捷的方法不适合工业化生产，因此需要在该领域开展持续研究，以期建立一种高效、准确、便捷且可供工业化生产的定量分析方法。