藏地甘草不同溶剂提取物甜味成分分析及应用

罗海涛，何力，任周营，邵灯寅

江西中烟工业有限责任公司技术中心（南昌 330096）

甘草为豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch）、胀果甘草（Glycyrrhiza inflataBat）或光果甘草（Glycyrrhiza glabraL.）的干燥根及根茎[1]。是临床常用、不可或缺的中药材。主要用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹、四肢挛急疼痛，痈肿疮毒，缓解药物毒性、烈性[2]。甘草的主要活性成分包含甘草酸、甘草苷和异甘草素等[3]。其中，甘草酸具有抗病毒、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗凝血、保肝、调节免疫、促进吸收等多种药理活性[4-5]。甘草酸也是甘草甜味的有效成分，它的特点是高甜度、低热能、安全无毒，起泡性和溶血性作用低。能与多种生物碱、抗生素、氨基酸等生成复盐或复方制剂，具有协同、增溶、增加药物稳定性、提高生物利用率及降低毒副作用的功效；并广泛用于食品添加剂、化妆品、烟草行业[6-7]。甘草制品包括甘草浸膏、甘草流浸膏、甘草粉及甘草酊等[7]，其在卷烟中应用能柔和烟气，润喉增甜，降低对鼻腔、喉部、口腔黏膜的刺激。

适用于卷烟嘴棒加香的甘草产品研究较少。试验选用产地来自天然无污染的云南德钦藏地甘草作为主要天然植物资源，采用不同溶剂提取甘草提取物，采用超高效液相相色谱/光电二级阵列检测器联用仪测定提取物中的甘草酸，采用GC-MS分析致香成分，并对提取物在嘴棒中的应用效果进行评价，为开发适合嘴棒使用、体现增甜增润功效的甘草提取物提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

5 L萃取釜（三艾斯玻璃仪器公司）；D2010W电动搅拌器（驰久牌）；DLSK-30/30低温冷却液循环泵（郑州科泰试验设备有限公司）；HH-WO多功能水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）；KQ-250DE型台式数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电子分析天平（梅特勒仪器有限公司）；中药粉碎机（上海淀久中药机械制造有限公司）；超高效液相相色谱/光电二级阵列检测器联用仪（Waters UPLC I-Class-PDA）、样品管理室、柱温箱分别配有独立可控温单元（美国沃特世公司）；7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪（配备自动进样器，美国安捷伦公司）；高速离心机（赛默飞世尔公司）；Biocel型Millipore Mill-Q超纯水系统（美国Millipore公司）；50 mL聚丙烯离心管。

甘草药材（产自云南德钦，云南德钦有时遇见熊商贸有限公司）。

甲醇、乙腈（均为色谱纯，美国TEDIA公司）；95%乙醇（食用级）、乙酸乙酯（分析纯）（均为国药集团化学试剂有限公司）。

甘草酸铵（纯度≥98%，中国药品生物制品检定所）。

1.2 不同提取工艺

将藏地甘草原料以年份、含水量等指标进行分级整理，挑选合适等级甘草经粉碎得甘草粗粉备用。参照《中国药典》（一部）[2]，结合香料提取物制备的实用需求，按以下工艺进行提取物样品制备。

1.2.1 水提法

称取500 g藏地甘草样品，加入4倍水，加热回流4 h，滤过，取滤液，减压浓缩，即得藏地甘草水提物。

1.2.2 乙醇提取法

称取500 g藏地甘草样品，加入4倍95%乙醇，加热回流4 h，滤过，取滤液，减压浓缩，即得藏地甘草醇提物。

1.2.3 乙醇初提-乙酸乙酯复提

称取500 g藏地甘草样品，加入2 L 95%乙醇，回流提取4 h，滤过，取滤液，减压浓缩，即得藏地甘草醇提物；取适量甘草醇提物，加入4倍乙酸乙酯，回流提取2 h，滤过，取滤液，减压浓缩，即得藏地甘草精提物。

1.3 甘草酸测定方法

1.3.1 标准溶液及流动相配制

流动相A，0.1%乙酸甲醇溶液；流动相B，20 mmol/L醋酸铵，0.1%乙酸水溶液。

于10 mL容量瓶中，准确称取甘草酸铵5 mg，精确至0.1 mg，以流动相A与流动相B体积比65∶35定容，得到质量浓度500 μg/mL的甘草酸铵储备液（甘草酸质量浓度489.8 μg/mL）。储备液置于-4 ℃下保存，有效期3个月。

将储备液分别以移液枪移取0.5，1.0，2.0，3.0和5.0 mL至10 mL容量瓶中，以流动相A与流动相B体积比65∶35定容，配制成甘草酸标准品质量浓度24.49，48.98，97.97，146.95和244.92 μg/mL的5级标准溶液。

1.3.2 色谱分析条件

色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱温30 ℃，样品管理室温度5 ℃，强洗溶液采用甲醇，弱洗溶液采用甲醇与水体积比1∶9，进样量2 μ L，检测器波长250 nm，流速0.3 mL/min，梯度洗脱，分析时间8 min。梯度洗脱程序见表1。

1.3.3 检测试液制备

分别称取1.4.1制备的提取物样品0.10 g于50 mL聚丙烯离心管中，加入50 mL流动相（流动相A与流动相B体积比65∶35），超声20 min，取上清液以0.22 μm有机滤膜过滤后，经超高效液相相色谱/光电二级阵列检测器联用仪检测，外标法定量分析。

1.4 GC-MS成分分析

1.4.1 样品前处理

准确称取0.5 g甘草提取物，加入250 μL 内标十七烷溶液和5.0 mL二氯甲烷，涡旋5 min，以5 000 r/min离心5 min，0.45 μm有机滤膜过滤，取1.0 mL待测。

1.4.2 仪器方法

色谱柱HP-INNOWAX（260 ℃，30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度250 ℃；进样量1.0 μL；分流模式分流比10∶1；恒流模式流量1.0 mL/min；升温程序：40 ℃保留1 min，3 ℃/min升至250 ℃，保留10 min。电子轰击（EI）离子源；电子能量70 eV；传输线温度250 ℃；离子源温度230 ℃；四极杆温度150℃；溶剂延迟5 min；扫描范围29～450 amu。

1.5 应用效果评价

分别将1.4.1制备的甘草提取物，用微量注射器按每支0.5 μL添加至金圣（硬红瑞香）嘴棒中，将注射好的烟支密封装袋，放入恒温22±1 ℃恒湿（相对湿度60%±2%）箱内平衡48 h以上，由评吸人员进行感官评价。

2 结果与讨论

2.1 标准品和供试样品色谱图

按照超高效液相色谱分离和分析条件，分别取甘草酸标准品溶液和甘草提取物供试样品溶液，自动进样器进样2 μL，得色谱图。分析结果如图1所示，甘草酸标准品出峰保留时间与甘草提取物样品中甘草酸出峰保留时间基本一致，与相邻色谱峰分离度好，无杂质峰干扰，满足甘草酸定量要求。

2.2 不同提取工艺提取物甘草酸含量

按甘草酸检测试样制备方法，分别取不同工艺制备的甘草提取物，制备测试溶液，经超高效液相相色谱/光电二级阵列检测器联用仪检测，测定甘草酸含量。结果如表2所示。结果显示相对于水提法，乙醇提取所得提取物中甘草酸含量明显较高，用乙酸乙酯对甘草醇提物进行复提，可使甘草酸等有效成分进一步富集，甘草酸含量最高。

2.3 致香成分分析

按GC-MS成分分析方法，分别对不同工艺制备的甘草提取物的致香成分进行分析，香气成分分析结果如表3所示。

如表3所示，甘草水提取的致香成分较少，主要为具有烘焙香的糖的裂解产物（糠醛、糠醇、5-羟甲基糠醛）、具有奶甜香的香兰素及其衍生物，如高香草醇、香草酸；甘草经醇提后进一步用乙酸乙酯提取所得提取物物的香气成分种类和总的香气含量明显增加，其中γ-丁内酯、麦芽酚、呋喃酮、α-吡咯烷酮、香兰素、油酸乙酯、亚油酸乙酯、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等化合物的含量大幅增加。γ-丁内酯、香兰素可以增加奶甜香，麦芽酚可以增加焦甜香，呋喃酮可增加焦甜、菠萝样果甜香；高级脂肪酸及其酯类如亚油酸、亚麻酸、油酸乙酯、亚油酸乙酯等对香味没有特别明显的直接作用，但可以调节烟气的酸碱度，使烟气醇和，在降低烟气粗糙感、改善口感等方面起重要作用。

图1 甘草酸标样色谱图（A）、甘草提取物和标样色谱对比图（B）

表2 不同提取工艺制备提取物的甘草酸含量

表3 不同提取方式甘草提取物致香成分分析

接表3

2.4 不同提取工艺提取物在嘴棒中的应用效果

分别将不同工艺制备的甘草提取物添加至卷烟嘴棒中，对其在卷烟嘴棒中的作用进行感官评价，评价结果如表4所示。

表4 不同工艺制备的甘草提取物在卷烟嘴棒中应用效果评价

经不同工艺所得的甘草提取物，在卷烟嘴棒中应用，可不同程度增加甜香，提升香气细腻圆润性，增加口腔甜润感。其中甘草水提物具有一定增甜效果，不过香气质感一般，微有杂气，烟气稍显粗糙，造成甘草水提物感官质量原因可能是：水提法在提取甘草中的甜味成分（甘草酸）等有效成分同时，部分大分子杂质也被提取，这部分杂质对香气质感会有影响，同时考虑到嘴棒用香原料多为脂溶性，因此水提法不适合嘴棒增甜剂的开发；甘草醇提物能增加甜香和甜味，一定程度上增加香气圆润和口腔的甜润感。对醇提物用乙酸乙酯复提精制，伴随着甘草酸等香味有效成分富集，所得提取物能够明显增加甜感，香气质感提升明显，香气细腻圆润，口腔甜润生津。感官评价结果与不同工艺制备甘草提取物中甘草酸含量及致香成分分析结果一致。结合甘草酸含量、致香成分分析和感官评价结果，可以判定采用乙醇初提-乙酸乙酯复提精制的工艺开发适合嘴棒添加的增甜增润甘草提取物具有优势。

3 结论

采用超高效液相色谱法和气相色谱质谱联用法对不同提取工艺甘草提取物中甘草酸等甜香成分进行分析，结果显示采用乙醇初提-乙酸乙酯复提精制所得甘草提取物中甘草酸含量较高，达71.36 mg/g，且γ-丁内酯、香兰素、麦芽酚、呋喃酮等甜香成分较为丰富。该提取物在卷烟嘴棒中应用能明显增加甜感，香气质感提升明显，香气细腻圆润，口腔甜润生津。对藏地甘草采用乙醇粗提，乙酸乙酯复提精制的工艺开发嘴棒用甜润剂具有较好应用价值。